[发明专利]一株能产生除草活性物质的铜绿假单胞菌菌株及其粗毒素制备方法

说明书

技术领域

本发明为一株铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)及其次生代谢产物用于控制杂草的方法，属于微生物应用于农业植物保护领域。 

背景技术

全世界约有3万余种杂草，其中1800多种能够对各种农业作物造成危害，每年会造成作物总产量约9.7％的损失。化学除草剂是目前常用的防治杂草的方法，但长期使用，其弊端也日益突出，如杂草产生抗药性、水体土壤污染、残留不易降解等。开发研制无污染、安全的新型除草剂已成为当务之急。生物除草剂具有对目标杂草以外的植物影响小、环境负效应小、安全性高的特点而备受人们的青睐，尤其是微生物除草剂以其开发周期短、成本低而越来越显示出独特的优势。微生物除草剂分为微生物活体除草剂和微生物次生代谢产物除草剂。次生代谢产物除草剂具有结构新颖、相对于活体制剂更易保存、多靶标作用位点、环境中易于降解等优点。 

近年来从自然界筛选出具有除草活性的细菌，成为生物除草剂开发研究的热点。已发现的具有除草效果的细菌主要包括如下几个属：假单胞菌属(Pseudomonas)，欧文氏菌属(Erwinia)，黄杆菌属(Flavobacterium)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，无色杆菌属(Achromobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)，产碱杆菌属(Alcalligenes)等。其中假单胞菌属有Zidack等发现丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)能使Kudzu叶片黄枯，局部坏死；Kenedy等报道荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)D7菌株可抑制旱雀麦(Bromustectrom L.)的生长；美国Banowetz等发现五株荧光假单胞菌(P.fluorescens)能够产生一种抑制早熟禾种子萌发物质。通过检索，尚未发现以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)提取物用做除草剂的相关文献报道。 

本发明为一种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株(编号CB-4)，及其粗毒素的制备方法。此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果，尤其是对马唐的种子萌发根茎长的IC₅₀分别达到299.25mg·L^-1和210.11mg·L^-1。而且具有安全环保，对农作物无害等特点。 

权利要求 

1、一种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年1月10日，保藏编号：CGMCC No.5721，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

2、权利要求1所述铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)，其特征在于：此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果。 

3、权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)粗毒素的制备方法。 

发明内容

一、一株铜绿假单胞菌菌株 

编号CB-4，(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年1月10日，保藏编号：CGMCC No.5721，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。此菌株由河北衡水市郊外农田中顶腐玉米病灶处分离得到，经生理生化实验和16S rDNA序列比对鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。此菌株形态为直形、两头钝圆的杆菌，大小0.5～0.8μm×1.5～3.0μm，一端生鞭毛，革兰氏染色为阴性，吲哚阴性，硝酸盐还原阳性，适宜生长温度35-37℃，可产生水溶性色素，将LB固体培养基染成蓝绿色。首次发现此菌株产生的粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果，相同浓度粗毒素施用于玉米、小麦、大豆、高粱植株均未见明显药害。CB-4菌株粗毒素具体除草效果见具体实施方式。 

二、铜绿假单胞菌CB-4菌株粗毒素的制备方法 

1、种子液制备，培养基配方：葡萄糖-10g，蛋白胨-10g，NaCl-5g，KCl-0.1g，MgSO₄-0.1g，蒸馏水1000mL，调pH至6.5-7.2。 

将按上述配方配制好的培养基倒入250mL三角瓶，每瓶100mL，121℃高压灭菌30min，冷却后在超净台内，无菌操作条件下，接种保存在-80℃甘油中的铜绿假单胞菌CB-4菌株，接种量1％，接种后放37℃，转速180rpm的摇床中培养24h，即为种子液。