[发明专利]黄嘌呤氧化酶抑制剂和/或超氧阴离子清除剂的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂和/或超氧阴离子清除剂的方法。

背景技术

黄嘌呤氧化酶是体内核酸代谢中重要的酶，广泛分布于人体心、肺、肝等组织细胞浆内。黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸，并产生过氧化物自由基。尿酸浓度过高会导致高尿酸血症，并可引起痛风发作。痛风症是因组织体液中的尿酸浓度过高而结晶并在关节析出导致关节疼痛的一种疾病，主要由于嘌呤代谢紊乱导致尿酸和超氧阴离子生成异常造成，已被联合国列为21世纪20大顽症之一。最新的流行病学研究表明，虽然中国人民生活水平不断提高，但饮食结构的不合理和生活节奏的加快，使痛风的发病率逐年上升，已高于世界平均水平。因此，黄嘌呤氧化酶抑制剂和自由基清除剂可以减少自由基造成的应激反应和对组织的伤害，也可以减少人体内尿酸的形成，是治疗痛风的重要药物，并能减少一些致命性的痛风并发症。

此外，近年来，冠脉解痉、各种动脉搭桥术、心脑血管栓塞再通(溶栓治疗、自然再通)、断肢再植、器官移植等诊疗技术在临床上广泛开展，各脏器缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion，I/R)的防治日益受到重视。缺血再灌注损伤是在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的现象。目前认为I/R损伤的机理与钙超载、氧自由基、炎性细胞等有关。缺血再灌注，导致细胞内钙超载。钙离子依赖蛋白的激活使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤脱氧酶，与堆积的次黄嘌呤和黄嘌呤反应，伴随大量氧自由基产生。过量的Ca²⁺还可以激活中性粒细胞，引起代谢“爆发”，产生大量的氧自由基。氧自由基既可使脂质发生过氧化反应，直接损伤细胞膜，导致细胞通透性增加，促进Ca²⁺内流；又可以破坏线粒体结构。钙超载和氧自由基相互影响、相互协同造成了I/R损伤。近年来，发现药物能减轻缺血再灌注损伤，如硝苯吡啶等化学药物，但毒副作用较大，因此，不少学者从中药寻找毒副作用小，效果确定的药物如芪丹中药提取物、黄芪注射液，以及从中药中分得的单体化合物如丹酚酸B。

有两种方法可减少人体内尿酸、超氧自由基的形成：一是降低人体内次黄嘌呤和黄嘌呤的含量，这可通过控制嘌呤类食物摄入来实现；二是降低人体内黄嘌呤氧化酶的活性，这可通过对酶的抑制作用来实现。目前临床上使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子自由基清除剂都有比较大的毒副作用。所以寻找黄嘌呤氧化酶抑制剂和研究黄嘌呤氧化酶的抑制作用在医学和人体代谢研究方面有着重要的意义。从天然药物中寻找有效、低毒、价廉的黄嘌呤氧化酶抑制剂或者超氧阴离子清除剂更是成为目前抗氧化剂研究的主要方向。传统的黄嘌呤氧化酶抑制活性或者超氧阴离子清除活性筛选方法都要求化合物从中药中分离、提纯出来并且需要足够大的量，通过体内、体外多种实验方法评价药用样品的活性，但是许多从中药中得到的天然化合物却难以满足这些条件。薄层色谱-生物自显影技术可以弥补以上技术的不足。薄层色谱-生物自显影是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高以及可以实现对生物活性的快速测定的特点。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对上述现有技术的不足而提供一种快速筛选复杂天然产物或者单体化合物中黄嘌呤氧化酶抑制剂或者超氧阴离子清除剂的方法。该方法具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高以及可以实现在复杂体系中对生物活性的快速测定的特点。

本发明为解决上述提出的问题所采取的解决方案为：采用薄层色谱-生物自显影技术建立黄嘌呤氧化酶抑制剂活性和/或超氧阴离子清除剂筛选模型，能够测定不同实验室，不同样品的黄嘌呤氧化酶抑制活性或者超氧阴离子清除活性的高通量筛选方法。该方法以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；该方法以薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的范围比紫外分光光度法更为广泛。

本发明所述的黄嘌呤氧化酶的催化活性是指在25-40℃下，黄嘌呤氧化酶催化底物生成尿酸和超氧阴离子的量。

本发明所述的黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术是是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，通过酶促反应产生的超氧阴离子自由基(O₂^.-)与氯化硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium，NBT)反应产生蓝紫色不溶物甲瓒(formazan)，具有抑制黄嘌呤氧化酶或者超氧阴离子清除作用的物质抑制了该反应的发生，在薄层板上表现为紫色背景下的白色斑点。