[发明专利]一种检测巯基化合物的荧光探针及其制备方法与使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种检测巯基化合物的荧光探针及其制备方法与使用方法。

背景技术

巯基是是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，它们是与酶活性有关最具反应性的官能团。大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等。体内某些巯基分子的含量直接与多种疾病相关，如癌症，帕金森症，心血管疾病等。因而发展快速，灵敏，简便的检测巯基的方法在生物化学和临床化学中具有重要意义。传统的检测方法有质谱法，高效液相色谱法，电化学法，分光光度法、比色法等，而这些方法灵敏度低，不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定。荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。

鉴于此，近年来巯基荧光探针成为了研究的焦点，并取得了较大的进展。如发展的芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类、芘类等，它们具有好的选择性和灵敏度，对巯基的检测限一般在纳摩尔（nmol）左右，但这些探针自身都有较强的荧光，用于活体细胞成像时会造成较低的信噪比；苯并呋喃磺酰卤类探针，虽然自身荧光较弱但是需要在碱性及高温条件下与巯基反应，也无法应用于活体细胞的荧光成像；而乙酰卤衍生物类巯基衍生试剂，能够在室温和生理PH下与巯基迅速反应，但是光稳定性较差，尤其是处于溶液中时不稳定，容易失去荧光团，因而也难以满足生物检测和荧光成像的要求。到目前为止，能够真正用于巯基化合物检测的高灵敏，高响应的探针还比较少见。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种基于2,4-二硝基苯磺酰基修饰的丹磺酰氯衍生物可用于巯基化合物检测的荧光探针及其制备与使用方法。

检测生物巯基的荧光探针有两部分组成：2,4-二硝基苯磺酰基为识别基团，丹磺酰氯衍生物为信息报告功能团，其结构如式I。

检测生物巯基的荧光探针的制备路线如下：

检测巯基化合物的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤一，式II的制备：将0.2～0.4 g对苯二酚溶于50 mL 的二氯甲烷中，再加入0.6 mL三乙胺，0℃条件下加入0.6～1.2 g丹磺酰氯，然后在室温下搅拌反应10～15小时，待反应结束后，蒸干溶剂，以硅胶柱进行分离。

步骤二，式I的制备：将0.6～1.2 g式II化合物溶于50 mL二氯甲烷中，并加入1.5 mL三乙胺,搅拌5分钟后,向反应体系内滴加溶有0.9～1.8 g 2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液10 mL，待滴加完全后，室温继续搅拌10～15小时，减压除溶剂，粗产品用硅胶柱层析进行分离纯化，以石油醚：乙酸乙酯= 4：1为洗脱剂洗脱，得到探针分子纯品。

所述的检测巯基化合物的荧光探针可应用于化学体系中含巯基化合物的检测，并可发展应用于生物活细胞和活组织内的巯基的分析检测。

检测生物巯基的荧光探针的使用方法包括以下步骤：

步骤一，测量探针分子的核磁共振波谱

步骤二，测定探针分子对巯基的选择性

将探针分子以少量DMSO溶解，再用无水乙醇配置成溶液；分别加入以无水乙醇溶解的待测样品，使最终探针分子的浓度为0.1 mM，而待测样品的浓度为5 mM；反应2小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而确定探针分子对巯基的选择性。

步骤三，测定探针分子对硫代乙醇酸的荧光-浓度曲线

将探针分子以少量DMSO溶解，再用无水乙醇配置成溶液；分别加入不同浓度的硫代乙醇酸，使最终探针分子的浓度为0.1 mM；反应2小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而得到荧光强度对浓度变化的曲线。

步骤四，测定探针分子对硫代乙醇酸的荧光-时间曲线

将探针分子以少量DMSO溶解，再用无水乙醇配置成溶液；加入硫代乙醇酸，使最终探针分子的浓度为0.1 mM，而硫代乙醇酸的浓度为5 mM；反应一定时间，检测荧光强度，进而得到荧光强度对时间变化的曲线。

本发明的有益效果：

1、探针分子合成简便，稳定性好，能够长期保存使用；

2、具有较高的巯基检测灵敏度；

3、具有优秀的选择性，与其它常见干扰分子无作用；

4、具有长的荧光发射波长（>500nm），能够有效地避免来自生物大分子小于500nm背景荧光的干扰，可应用于生物体系的检测。

附图说明