[发明专利]一种高效CpG制剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于兽用疫苗技术领域，涉及一种兽用疫苗佐剂及其制备方法和应用，具体涉及一种高效的疫苗佐剂CpG制剂及其制备方法和应用。

背景技术

国内众多兽用疫苗生产企业的疫苗佐剂均是用铝佐剂或油佐剂，但该类佐剂有一定的副作用，油乳剂刺激局部产生肉芽肿或炎症反应：铝佐剂可以引起注射部位局部炎症反应进而引起肉芽肿，个别的引起畜禽应激性反应导致个别个体死亡。且诱导的免疫应答是属于Th2型的，不足以起到完全的保护动物防感染的作用。虽然能增强体液免疫，抗体以IgGⅠ类为主，不能明显地提高细胞介导免疫应答，不能增强细胞免疫，有局限性；还可能对动物体的神经系统造成伤害。主要适用于免疫能力强和可大量生产的抗原。因此制备安全高效的疫苗佐剂是非常必要的。

含有特定非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG基序)的寡核苷酸，即CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)是近年发现的被哺乳动物的免疫系统识别为“危险”信号的新型免疫增强剂，能激活人体和许多动物的先天性和适应性免疫系统。在多种动物模型上，已证实CpG ODN可作为疫苗(包括人用疫苗)一种安全的疫苗佐剂，而且与传统疫苗相比，可以较大程度减少疫苗抗原的使用量，因而过敏反应的可能性大幅度降低，部分已进入人体的二期临床研究(Murad和Clay，2009；Vollmer和Krieg，2009)。

由于CpG ODN是一种安全的佐剂，多次动物实验已经证实高达100倍常规剂量的CpG ODN注射小鼠未发现明显的急性毒性作用，反复注射CpG ODN可为长期预防传染性病原体提供一种安全的方法(Klinman等，1999)。CpG ODN作为佐剂，可以诱导Th1型免疫应答，提升细胞免疫应答的水平，还具有降低疫苗的使用量，减少过敏反应等的优点。

但是，目前尚没有将CpG直接应用到动物的疫苗免疫产品，主要原因在于其存在稳定性不强，时间长存放易降解，导致药效下降；保存条件较苛刻，要求在-20℃下等问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有的兽用疫苗佐剂不足，尤其是具有副作用、诱导Th2型免疫应答、只能适用于免疫能力强和可大量生产的抗原的技术难题，提供一种高效的疫苗佐剂CpG制剂，基于所述制剂，可成功实现降低疫苗的使用量、促进动物机体Th1型免疫的形成、提高疫苗的使用效果的目的。另一方面，本发明所述制剂较现有的CpG制剂更容易保存。

本发明的另一个目的是提供所述CpG制剂的制备方法，所述的制备方法简单易行。

本发明还有一个目的是提供所述CpG制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

本发明提供一种高效CpG制剂，包括按照以下比例组成的各组分：

所述CpG ODN的序列为：5’-ggTGCATCGATGCAGggggg-3’，可采用现有基因工程或化学方法合成，其中g-表示该序列经硫代化处理(硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行)。合成后，用无菌PBS溶液配制成10～45μg/ml，保存于-15～-25℃温度下备用。所述PBS溶液组成为：按照重量百分比计，0.6～1.0％的NaCl、0.01～0.04％的KCl、0.0124～0.0164％的Na₂HPO₄、0.014～0.034％的KH₂PO₄溶于水中；然后采用湿热高压灭菌法在115～121℃下，灭菌15～25min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。

本发明同时提供所述CpG制剂的制备方法，将人工合成的CpG ODN与其他成份配合，再经乳化后，制备成CpG制剂。具体包括以下步骤：

(1)CpG ODN合成后，采用无菌PBS溶液配制成浓度为10～45μg/ml的CpG ODN溶液，-15～-25℃温度下保存备用；

(2)取160～180ml白油和10～14ml Span-80和6～10ml Tween-80，混合均匀得混合液，60～80℃水浴处理；

(3)取20～40ml EMULSIGEN水包油佐剂与步骤(2)所得混合液混合均匀，保存备用；

(4)往步骤(1)所得80～120ml CpG ODN溶液中加入步骤(3)溶液中，混合均匀，室温放置。

其中，步骤(2)所述混合均匀是在200～600rpm/min下搅拌4～8min；所述水浴处理是在60～80℃水浴20～30min。