[发明专利]含组氨酸标签重组人内皮抑素质谱绝对定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用质谱技术来绝对定量组氨酸标签重组人内皮抑素的方法

背景技术

内皮抑素具有广泛的抗肿瘤血管生成作用，其作用机制是通过抑制形成血管的内皮细胞迁移而抑制肿瘤新生血管的生成，阻断肿瘤的营养供给，从而抑制肿瘤增殖或转移。2005年SFDA批准了重组人血管内皮抑制素注射液(恩度)，作为首个血管内皮抑制素肺癌新药，该重组人内皮抑素含有组氨酸标签。作为上市的药物，重组人内皮抑素的生物样品定量方法对于评价药物在体内的动力学行为具有重要的意义。现有的重组人内皮抑素的定量方法主要有放射性同位素标记(Current Drug Metabolism，2006，7，565-576)和酶联免疫吸附实验(J.Clin.Oncol.21(2003)223-231)，尚无质谱定量方法。放射性同位素标记方法对操作人员和环境有特殊要求，相对于酶联免疫吸附实验方法质谱定量技术具有更好的选择性和精密度。因此建立一种基于质谱的组氨酸标签重组人内皮抑素的定量方法是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，建立一种含组氨酸标签重组人内皮抑素的生物样品提取方法并建立其质谱定量方法。

本发明采取的技术方案是，首先利用含金属Ni²⁺琼脂糖凝胶树脂提取血浆中的含组氨酸标签重组人内皮抑素，经洗脱后用胰蛋白酶水解，选取胰蛋白酶水解的重组人内皮抑素的特异性肽段，选择的特异性肽段是该的蛋白胰酶水解后独有的。基于高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，利用多重反应监测(MRM)模式对特异性肽段进行分析，建立可靠，稳定的LC-MS/MS定量方法。合成一段与特异性肽段相似的合成肽段作为内标，进行定量分析建立标准曲线，从而实现特异性肽段的定量。

本发明的具体技术方案如下所述。

一种含组氨酸标签重组人内皮抑素质谱定量方法，包括生物样品的提取方法和质谱定量方法，具体步骤如下：

A、生物样品制备方法：

(1)样品提取柱的制备：200μL含金属Ni²⁺琼脂糖凝胶(Ni²⁺Sepharose)加入离心柱，冷冻离心机离心去除液体(500g，1min)。加入平衡液放置于涡旋混合器(900rpm，5min)，离心冲洗两次。预备上样。

(2)生物样品的提取：含重组蛋白血浆200μL加入样品提取离心柱，4℃放置于涡旋混合器(900rpm，20min)使蛋白与树脂充分结合，离心(500g，1min)去除液体，加入400μL平衡液置于涡旋混合器(900rpm，5min)洗两次，再加入400μL杂质洗脱液置于涡旋混合器(900rpm，5min)洗脱杂质，最后加入400μL蛋白洗脱液置于涡旋混合器(900rpm，5min)洗脱目的蛋白。

(3)蛋白样品的胰蛋白酶消化：将提取后的蛋白洗脱液用离心超滤方法置换为100μL的消化缓冲液，再加入2μL胰蛋白酶溶液，涡旋混合，37℃孵育12小时得酶解样品，加入2μL酶解反应终止液和2μL内标溶液后用于质谱定量。

B、LC-MS/MS检测方法：

(1)色谱条件为：Shimadzu LC(SLC-20A)型液相色谱系统；色谱柱：Agilent300SB-C8column(3.5μm，150mm×2.1mm)；流动相：含0.1％甲酸的水，乙腈，梯度洗脱；柱温40℃，流速：0.2mL/min；进样量10μL。

(2)质谱条件为：API 4000型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst 1.3据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；电喷雾电压为5500V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40PSI；气体2：氮气压力60PSI；气帘气：氮气压力25PSI；扫描方式为多重反应监测；特异性肽段和内标的序列和检测m/z以及其相应的DP和CE值见表1；

表1肽段MRM监测值

C、标准曲线的制备：

(1)利用空白血浆将重组人内皮抑素蛋白储备液(5mg/mL)分别稀释至50，100，200，500，1000，2000，5000，and 10000ng/mL。