[发明专利]中国南海信号芋螺毒素Lt7b的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。属于生物领域。

背景技术

芋螺(Cone snails)，俗称为“鸡心螺”，其在分类学上隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、新腹足目(Neogastropoda)、芋螺科(Conidae)、芋螺属(Conus)。地球上现存的芋螺物种约有700多种，主要分布于温暖的热带或亚热带海域，其中以印度-太平洋区域和东太平洋-西大西洋区域最多。芋螺一般生活在岩石、珊瑚礁、沙和泥沙质的海底。少数物种可以栖息在几十米至200余米的深水区。白昼或退潮后在海藻下或珊瑚洞中栖息，夜晚外出觅食，春季和夏季为其主要的繁殖期。我国现今发现了约有80多种芋螺，主要分布于南沙群岛、西沙群岛、海南岛及台湾附近海域，少数分布在广东、广西沿海。

芋螺按其食性可分为三大类：食鱼芋螺(piscivorous)，食螺芋螺(molluscivorous)和食虫芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数较少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的。

芋螺的毒液是其捕食、防御和竞争的主要武器。毒液由芋螺毒管的上皮细胞分泌产生，并储存于毒管末端的毒泡中。毒液的主要活性成分是复杂的鸡尾酒样的混合毒素多肽，即芋螺毒素(conotoxin)。每种芋螺个体的毒液中大约含有100-1000种成分，其中的绝大部分都是芋螺毒素。

近几十年来的研究表明，芋螺毒素主要作用于细胞膜上各种离子通道和神经递质/激肽的受体，且具有很强的生物学活性。芋螺毒素具有如下特点：分子质量小，富含二硫键；前导肽高度保守而成熟肽具有多样性；作用靶点广且具有高度组织选择性。芋螺毒素常被作为探针用于各种离子通道和受体的类型及亚型的分类和鉴定，也极有望直接开发成药物或作为先导化合物用于新药的研发。

目前，国内外已明确功能的芋螺毒素只占了整个毒素库的很小一部分，但是对它们的生理功能已经有了较为清晰的认识。芋螺毒素二硫键骨架和结构的不同，决定了它们功能靶位的差异，已经清楚的靶位主要包括配体门控的离子通道、电压门控的离子通道及G蛋白偶联的受体。

二十世纪七十年代，美国犹他大学教授B.M.Olivera的实验室最早开始了对芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二硫键骨架)，可分为不同的超家族和骨架类型。至今已经得到分离的芋螺毒素有数千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的芋螺毒素ω-MVIIA(SNXIII，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-芋螺毒素CVID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。

另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种中国南海信号芋螺毒素基因Lt7.2，其基因序列如序列表中序列1所示。

本发明的第二个目的是提供上述信号芋螺毒素基因Lt7.2编码的多肽Lt7b，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体pTRX-Lt7.2。

本发明的第四个目的是提供一种多肽的表达方法，从表达、分离和纯化几个方面对原有的多肽表达方法进行改良。

本发明的第五个目的在于提供上述芋螺毒素多肽Lt7b在神经生物学研究及镇痛药物开发中的应用。

本发明使用的信号芋螺采自中国海南省三亚市。

本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海信号芋螺毒管中分离得到中国南海信号芋螺毒素基因Lt7.2。