[发明专利]中国南海织锦芋螺毒素TxO10的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。属于生物领域。

背景技术

芋螺(cone snail)是一种生活在海洋浅水域的肉食动物，有毒，属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、芋螺科(Conidae)、芋螺属(Conus)。目前估计全球有约500-700种芋螺，它们分布于热带海域的浅水区域，主要是印度洋和太平洋海域。

芋螺按其食性可分为三大类：食鱼性芋螺(piscivorous)，食软体动物性芋螺(molluscivorous)和食虫性芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数最少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的。

芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一类来源于芋螺(Conus)毒液的活性多肽.对芋螺自身而言，CTx主要用于捕食与防御.。近几十年来的研究表明，它主要作用于细胞膜上各种离子通道和神经递质/激肽的受体，有很强的生物学活性。芋螺毒素具有有如下特点：分子质量小，富含二硫键；前导肽高度保守而成熟肽具有多样性；作用靶点广且具有高度组织选择性。芋螺毒素常被作为探针用于各种离子通道和受体的类型及亚型的分类和鉴定，也极有望直接开发成药物或作为先导化合物用于新药的研发。

目前，国内外已明确功能的芋螺毒素只占了整个毒素库的很小一部分，但是对它们的生理功能已经有了较为清晰的认识。芋螺毒素二硫键骨架和结构的不同，决定了它们功能靶位的差异，已经清楚的靶位主要包括配体门控的离子通道、电压门控的离子通道及G蛋白偶联的受体。

二十世纪八十年代初，美国犹它大学Olivera BM学者实验室最早开展了芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二硫键骨架)，可分为不同的超家族。至今已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX MVIIA(SNXIII，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-CTX CVID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。

另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种中国南海织锦芋螺毒素基因TxO₁₀，其基因序列如序列表中序列1所示。

本发明的另一个目的是提供上述织锦芋螺毒素基因TxO₁₀编码的多肽TxO₁₀，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体pTRX-TxO₁₀。

本发明的再一个目的是提供一种多肽的表达方法，从表达、分离和纯化几个方面对原有的多肽表达方法进行改良。

本发明的第五个目的在于提供上述芋螺毒素多肽TxO₁₀在神经生物学研究药物开发中的应用。

本发明使用的织锦芋螺采自中国海南省三亚市。

本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海织锦芋螺毒管中分离得到中国南海织锦芋螺毒素基因TxO₁₀。

本发明提供一种重组表达载体pTRX-TxO₁₀，通过以下方式合成：