[发明专利]一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株缓解葡萄糖阻遏又提高了抗逆性的高效利用乳糖的酿酒酵母工程菌。

背景技术

乳清是指在制造干酪或干酪素时，分离出絮凝物后剩下的极稀薄的液体，是工业生产干酪及干酪素的副产品，每生产1t的干酪产生9t乳清，含有牛奶中55％的营养，但是由于乳清具有很高的BOD(生物耗氧量)和COD(化学耗氧量)，所以对环境造成很大的负担。目前，全球乳清产量约为16亿吨，而只有其中的50％得到处理，用于食品、饲料等方面，剩下的约8亿吨没有得到有效利用，被排泄到自然界中，不但造成环境的污染，而且还造成该资源的巨大浪费。乳清中除了含有20％乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，约占乳清5％左右，是产生高BOD和COD的主要原因。

如何利用乳清中的乳糖，从而减低乳清对环境的污染一直是乳制品行业关注的问题。乳清的利用主要有以下几个方向：用于食品行业、用于饲料行业、用于医药行业。但是随着全球能源危机的加剧，以及世界粮食安全问题等因素，乳清成为新的生产燃料乙醇的主要原料，也使得利用乳清生产燃料乙醇成为一个全新的热点。

目前国外利用乳清生产燃料乙醇已有40多年的历史，所使用的菌种主要有克鲁维酵母和酿酒酵母。克鲁维酵母虽然能够利用乳糖，但是该属酵母酒精产率低，抗逆性差，菌体生长量大，不适用于生产乙醇。酿酒酵母虽然是生产乙醇的最佳首选，但是野生型酿酒酵母不能够利用乳糖为唯一碳源，所以如何改造酿酒酵母，使其可以发酵乳糖产乙醇，一直是科研人员的研究热点。目前国外的解决方法主要分为以下几种：一、是利用原生质体融合技术，对酿酒酵母及克鲁维酵母进行融合，筛选即可以利用乳糖又能高效产乙醇的突变株；二、是采用基因工程手段，把外源基因导入到酿酒酵母体内，使得酿酒酵母具有分解乳糖的能力，从而解决其不能利用乳糖的问题。目前导入最多的外源的基因为克鲁维酵母的LAC4基因(编码乳糖分解酶)和LAC12基因(编码乳糖通透酶)。但是上述两种方法均存在生长缓慢，酒精耐性低等问题。

在酿酒酵母中，胞内海藻糖含量的提高可以改善其抗逆性，胞内海藻糖在中性海藻糖分解酶作用下分解，因此阻断或敲除中性海藻糖酶基因可以提高胞内海藻糖含量。又因为乳糖在乳糖分解酶作用下首先分解成为半乳糖和葡萄糖，在酿酒酵母中，葡萄糖的存在会严重抑制半乳糖的利用，该现象被称为葡萄糖阻遏。葡萄糖存在时，会激活葡萄糖阻遏蛋白复合物，复合物会抑制半乳糖利用所需酶基因的转录。因此，阻断葡萄糖阻遏蛋白复合物的合成可以降低葡萄糖阻遏现象。

在酿酒酵母中中性海藻糖分解酶是由NTH1和NTH2基因编码，其中起主要作用的是NTH1编码的蛋白。而葡萄糖阻遏蛋白复合物是由三个蛋白组成的复合物，其中只有由MIG1编码的Mig1蛋白同半乳糖利用所需酶基因结合，抑制其转录。目前，国内外还未见有过表达LAC4和LAC12基因同时敲除NTH1和MIG1基因的报道。

发明内容

本发明的目的是解决野生型酿酒酵母不能够利用乳糖为唯一碳源，而经基因工程改造的酿酒酵母存在生长抑制和抗逆性低的问题，提供一株能够高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌株。

本发明首先提供了一株可以利用乳糖的酿酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiae AY-510B24M，该菌株于2012年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，菌种保藏号CGMCC No 5843。

本发明所述利用乳糖酿酒酵母工程菌株的构建如下：

1)将PGK1(磷酸甘油酸激酶)启动子和终止子与pUC19质粒连接得到pUC-PGK1；

2)将来源于酿酒酵母的同源片段NTH1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-NTH1；

3)将编码乳糖分解酶LAC4基因插入到第2步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-NTH1-LAC4；

4)将sh ble基因连接到第3步得到的pUC-PGK1-NTH1-LAC4上，得到质粒pUC-PGK1-NTH1-LAC4-sh ble；

5)将来源于酿酒酵母的同源片段MIG1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-MIG1；

6)将编码乳糖通透酶LAC12基因插入到第5步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-MIG1-LAC12；