[发明专利]一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌。

背景技术

如何提高酒中酯香物质的含量，一直是我国普通白酒、黄酒企业和相关科研单位研究的重要课题。目前提高普通白酒酯含量的主要方法有如下三种：一是固液结合法，用液态法生产酒基，用固态法的酒糟、酒尾或成品酒来提高质量；二是调香法，用天然香料调制或用纯化学药品按某一名酒的香味成分组成来进行调香；三是全液法，在发酵醪中加入产香微生物，己酸菌发酵液或将己酸发酵液经化学、生物法酯化后，再加到发酵醪中。这些提高酒中酯香物质含量的方法大多是从工艺水平上进行的，虽然酯含量有一定提高，但酒质与高档名酒相差仍很大，特别是化学药品的加入存在安全隐患。因此，要从根本上解决酿酒酵母的产酯能力还是需要利用分子生物学育种技术构建高产酯的酿酒酵母工业菌株。

研究表明，乙酸酯类，如乙酸乙酯(溶剂类香气)和乙酸异戊酯(香蕉风味)，是酒中主要的风味活性酯。这些酯类的形成是在酵母代谢时在酵母内合成的，形成的酯一部分通过细胞扩散到发酵液中，一部分被酵母吸附，留在细胞体内。提高这些乙酸酯的含量不仅可以增进酒的酯香，同时能有效地扩张、松驰神经，可减少喝酒引起的副作用。

参与乙酸酯合成的酶主要是醇乙酰基转移酶(AATase)，它可以催化醇和乙酰辅酶A形成乙酸酯。该酶是一种巯基酶，有三种不同的类型：AATase I、Lg-AATase I和AATase II，分别由ATF1、Lg-ATF1和ATF2编码。酿酒酵母只含有一个ATF1基因，而啤酒酵母除了含有ATF1基因外，还含有一个同源基因Lg-ATF1基因。而国内还没有醇乙酰基转移酶及其编码基因对白酒和黄酒风味和品质影响的相关研究。

发明内容

本发明的目的是解决酿酒酵母自身产酯能力较低的问题，提供一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌。

本发明提供的含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，具体为EY-15，已于2011年12月22日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No 5636。

所述的酿酒酵母工程菌，在其它发酵性能不受影响的情况下，模拟半固态发酵后，转化子菌株与亲本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2.1525)相比，乙酸乙酯含量提高1.6倍，乙酸异戊酯的含量提高到26.6mg/L。

本发明所述含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌的构建方法是：

1)将PGK1启动子和终止子与pUC19质粒连接得到pUC-PGK1；

2)将来源于酿酒酵母的同源片段IAH连接到第1)步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-IAH；

3)将啤酒酵母中编码醇乙酰基转移酶Lg-ATF1基因插入到第2)步得到的pUC-PGK1-IAH中PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-IAH-Lg-ATF1；

4)将kan基因连接到第3)步得到的pUC-PGK1-IAH-Lg-ATF1上，得到质粒pUC-PGK1-IAH-Lg-ATF1-kan(以下简称pUC-PILgK)；

5)将第4)步构建的过表达质粒pUC-PILgK用Bpu1102I酶切，用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株；

6)将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌(双倍体)。

本发明同时提供了一种专门用于鉴定含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌的基因序列，该基因序列是以Lg-U和Lg-D为引物，以所述含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表1所示。

模拟半固态发酵：将酵母菌接入5mL麦芽汁培养液中，30℃过夜培养12h；将菌液全部转至20mL新鲜麦芽汁培养液中，30℃培养24h。取100g粳米置于25～30℃的水中，浸渍72h；取出后洗净，常压蒸煮30min。将米摊凉，投入500mL三角瓶中，加入10g熟麦曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麦芽汁培养液，28℃发酵5天。对发酵液进行分析，包括失重、酒度、残糖和GC测定香气成分含量。