[发明专利]鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，属于一种新的快速、特异诊断方法，主要用于临床猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病、PRRS）与高致病性猪蓝耳病（HPRRS）的鉴别诊断及流行病学调查；应用于畜牧兽医学领域。

背景技术

猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病。本病于1987年首先爆发于美国，随后迅速传到世界各地，现已成为危害规模化养猪生产的重要疫病之一。而2001年至今，我国每年都有部分地区不同程度的受到猪“高热病”的危害，经一系列的研究表明，引起“高热病”的最主要病原为变异的高致病性的PRRSV。PRRSV属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，单股正链有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圆形，直径为45~65nm，含有20~35nm的核衣壳，呈二十面体对称，外绕一脂质双层膜，表面有纤突，较小且不清楚。在我国分离的毒株属于北美洲型，如VR2332株。经测序表明，与经典毒株相比，病原的序列变化主要是在Nsp2区缺失了30个氨基酸，并且致死率明显高于经典毒。可见，Nsp2中30个氨基酸的缺失与否，成为鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。

目前猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测主要采用的技术方法有：酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFA）、病毒分离、RT-PCR、荧光RT-PCR、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）、血清中和（SVN）试验等。比较快速准确的技术是ELISA和荧光RT-PCR，但这2种技术都需要特殊的仪器设备，并且检测时间都在2小时以上，检测成本昂贵，不便于实时和快速鉴别诊断经典猪蓝耳病及高致病性猪蓝耳病。这些限制了猪蓝耳病的预防控制，因此研制出一种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。

　　免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用形成一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团牢固结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，基于二者的差异，利用免疫学抗原抗体能够特异性结合原理，胶体金标记经典PRRS特有抗原后与待检样品中相应抗体结合，这种抗原抗体复合物被检测线上的SPA（葡萄球菌蛋白A）截留而出现颜色反应，肉眼可见，则可判断是经典猪蓝耳病；其方法具有简单、快速、敏感和特异性好等特点；并且价格低廉，适用于基层或临床鉴别诊断经典猪蓝耳病及高致病性猪蓝耳病。

本发明的技术方案是这样实现的：一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于：试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的经典PRRSV特有抗原；硝酸纤维素膜上分别包被有SPA构成的检测线T线和抗经典PRRS单克隆抗体2B9构成的质控线C线。

所述的结合垫上包被的胶体金标记PRRS特有抗原，其制备方法如下：（1）将公司合成好的PRRS Nsp2区30个氨基酸即经典PRRS特有抗原，用该抗原标记胶体金，制备金标抗原，用0.1M碳酸钾调胶体金的PH值至8.2，按100ug抗体/毫升胶体金加入经典PRRS特有抗原，磁力搅拌器混匀30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。4℃ 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4℃备用。

（2）将结合垫浸泡于封闭液即2%BSA、0.5%吐温－20、2.5%蔗糖、0.05%叠氮钠、0.01M　PBS中30分钟，37℃烘干；然后将制备好的金标抗原均匀喷涂于结合垫上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。