[发明专利]银杏内生真菌的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种其发酵物具有抑制植物病原真菌的活性的微生物。

背景技术

在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减轻病虫草危害，保证粮食丰产丰收，起到积极的作用。但是由于自然界生物之间相互依存、相互制约，过分依赖化学农药的毒杀作用，产生一些地区发生盲目滥施农药的现象，特别是一些残效期长和毒性大的农药使用，导致一系列食品安全、人类健康和生存环境问题。目前化学防治的危害逐步被人们所认识，研制安全、高效、环保的新型农药已成为发展的方向和研究的主题。生物农药因对人、畜低危险性，使用安全，对环境友好，不易产生抗性等优点，成为新农药产业发展的热点和重点。

植物内生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物组织内或生活史中的某一阶段生活在植物组织内，对植物组织不引起明显变化的真菌，包括那些生活史中某一阶段能营造表生生活的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌(Latent pathogens)和菌根菌(Mycorhiza fungi)。植物内生真菌具有明显的多样性和普遍性。在目前所有研究过内生真菌的植物中，都有其存在，少则十几种，多则近百种。植物内生真菌与宿主植物长期的共生过程中，构建了内生真菌特殊的生长环境，使得内生真菌能够产生许多与结构新颖、生理活性独特的天然化合物。具有安全、无残留、不在人畜体内积累、防治效果专一等优点，为农药先导化合物和新型生物农药的研究和应用开拓了美好前景。当前利用植物中分离的内生真菌获得生理活性物质已成为研究热点，已有多项研究表明植物内生真菌能产生新型的抑菌活性的物质。如White等从禾本科植物中分离的内生真菌枝顶孢(Acremonium coenophilum)对多种体外培养的农作物病原真菌有抑制作用。Findlay从黑云杉(Picea mariana)中分离到内生真菌(Conoplea elegantala)的液体发酵产物中分离出两个新的苯并吡咯类活性成分，对由丝核菌(Rhizoctonia spp.)和镰刀菌(Fusarium spp.)引起的病害有很好的防效，水稻立枯病、恶苗病等病害有良好的防治作用。顾爱国从苦皮藤内生真菌(Fusarium proliferatum)中分离到恩镰孢菌素(eniatinns)类化合物，其对植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用。

银杏(Ginkgo biloba L.)素有裸子植物“活化石”和“植物界熊猫”之称，是中国特有的珍贵树种，在漫长的生长期中几乎不感染病虫害，寿命极长。根据内共生理论推断，银杏中很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的次生代谢产物帮助增强银杏的抗病害能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离自中国安徽省合肥市银杏(Ginkgo biloba L)植物活体中，且其发酵产物具有较强的抑制植物病原真菌活性的微生物，即银杏内生真菌。

本发明所描述的银杏内生真菌命名为腐皮镰孢菌(Fusarium solani T-7)，现保藏在国家知识产权局指定的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5089。

本发明所描述的银杏内生真菌系从中国安徽省合肥市银杏(Ginkgo biloba L)植物活体中分离得到的。

本发明银杏内生真菌的具体分离纯化操作步骤如下：

(1).银杏组织的准备：采集银杏的根、茎、叶；

(2).银杏组织的表面消毒与无菌检测：将步骤(1)采集的根依次在浓度70％的酒精中浸泡1min、在浓度0.2％的次氯酸钠溶液中浸泡2min；将采集的茎依次在浓度70％的酒精中浸泡50s、在浓度0.2％的次氯酸钠溶液中浸泡90s；将采集的叶片依次在浓度70％的酒精中浸泡40s、在浓度0.2％的次氯酸钠溶液中浸泡60s；将浸泡过的根、茎、叶用无菌水冲洗3次，阴干，得到消毒后的根、茎、叶；用消毒手术刀将消毒后的根、茎、叶分别切成0.5cm×0.5cm大小的根块、茎块、叶块；接着将一部分根块、茎块、叶块直接种植于第一块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～7天；