[发明专利]糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒

权利要求书

1.一种糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法，其特征在于：包括步骤：

①固相抗体制备

将抗糖类抗原19-9单克隆抗体稀释后，作为包被液，包被固相材料，形成具有固相抗体的固相材料；

②镧系元素离子标记抗体制备

选用配对的第一抗糖类抗原19-9单克隆抗体和第二抗糖类抗原19-9单克隆抗体，分别进行镧系元素离子标记，形成标记抗体A、B；

③在步骤①制得的具有固相抗体的固相材料中，加入糖类抗原19-9标准品或待测样品，以及反应缓冲液，经孵育、洗涤固相材料后，加入稀释的混合标记抗体A和B，再次孵育后进行荧光检测。

2.如权利要求1所述的分析法，其特征在于：所述步骤①中，具体制备步骤，包括：

(1)将抗糖类抗原19-9单克隆抗体用包被缓冲液稀释至抗体浓度为1.0～10.0μg/ml，作为包被液，与固相材料接触并静置5～24小时；

其中，包被缓冲液包括：pH 9.3-9.7的50mM碳酸盐缓冲溶液；

固相材料包括：微孔反应条、或由微孔反应条形成的微孔反应板；

(2)用含表面活性剂的缓冲液，洗涤步骤(1)制备的抗体包被的固相材料后，加入含封闭蛋白的缓冲液，静置3～12小时；

其中，含表面活性剂的缓冲液，包括：含0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液，而50mM pH 7.8TSA缓冲液为50mM Tris，含150mM NaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

含封闭蛋白的缓冲液，包括：含0.5％酪蛋白的0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液；

(3)弃去含封闭蛋白的缓冲液，干燥固相材料，完成固相抗体制备。

3.如权利要求1所述的分析法，其特征在于：所述步骤②中，镧系元素离子包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Tb³⁺；

形成镧系元素离子的试剂与抗糖类抗原19-9单克隆抗体的质量比为1∶2～1∶1。

4.如权利要求3所述的分析法，其特征在于：所述步骤②中，镧系元素离子为Eu³⁺。

5.如权利要求1所述的分析法，其特征在于：所述步骤③中，糖类抗原19-9标准品的制备方法为：先分别将糖类抗原19-9稀释至所需的最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度，获得糖类抗原19-9标准品。

6.如权利要求5所述的分析法，其特征在于：所述标准品为用含20％小牛血清、0.1％NaN₃的生理盐水将糖类抗原19-9配制成标准品。

7.如权利要求1所述的分析法，其特征在于：所述步骤③中，反应缓冲液包括：pH 7.6-8.0的50mmol/L Tris-HCl，内含0.9％NaCl、2％BSA、0.05％牛IgG、0.1％Tween-20和0.1％NaN₃。

8.如权利要求1所述的分析法，其特征在于：所述步骤③中，在20-25℃孵育1～2h后，采用含表面活性剂的缓冲液的稀释液作为洗涤液，洗涤固相材料，其中，含表面活性剂的缓冲液，包括：含0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液，而50mM pH 7.8TSA缓冲液为50mM Tris，含150mM NaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

含表面活性剂的缓冲液的稀释液，是将含表面活性剂的缓冲液与水以体积比为1∶24的比例稀释；

稀释的混合标记抗体A和B为：先将单独标记好的抗体A和B按照质量比3∶1的比例混合至使用浓度的20倍，再将混合后的标记抗体用反应缓冲液以体积比为1∶20稀释；稀释的混合标记抗体A和B中的标记抗体总浓度为1-5μg/ml；

再次孵育中，在20-25℃孵育1～2h。

9.如权利要求8所述的分析法，其特征在于：所述步骤③中，再次孵育之后，经再次洗涤固相材料后，加入增强液进行荧光检测；

其中，增强液为含1.0％冰乙酸和2.0％邻苯二甲酸氢钾的缓冲液，pH 3.0-4.5，该缓冲液中同时含有0.4％β-萘基甲酰三氟丙酮、2％三正辛基氧膦、0.1％Triton X-100。