[发明专利]蛋白酶抑制剂BmSPI38及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

家蚕是一种具有很高经济价值的产丝昆虫。然而，家蚕易受各种病原微生物和其它外界因素影响，产生疾病。昆虫致病性真菌，如绿僵菌、球孢白僵菌、黄曲霉菌和米曲霉菌，都可引发高传染性蚕病。一旦这些致病性真菌在桑蚕区传播开来，将对茧丝产量和质量造成重大损失，甚至导致整个桑蚕行业的失败。所以，采取有效措施控制家蚕真菌疾病非常重要。

超微结构和组织化学证据表明，昆虫致病性真菌主要通过机械压力和酶解双重作用来穿透昆虫体壁，进而入侵昆虫。其中，体壁降解蛋白酶在孢子萌发时分泌于昆虫体壁，参与宿主表皮穿透过程，是重要的毒力因子。例如，绿僵菌分泌的体壁降解蛋白酶Pr1可以激活烟草天蛾的酚氧化酶系统，增加Pr1基因拷贝数，从而显著提高绿僵菌的毒力；球孢白僵菌分泌的体壁降解蛋白酶CDEP-1能够加速孢子萌发和体壁穿透过程，从而显著提高球孢白僵菌的毒力。

蛋白酶抑制剂广泛存在于各种生物中，它们通过结合蛋白酶或介导蛋白酶受体清除信号来消除不需要的蛋白水解过程。目前，在自然界中共发现了四种蛋白酶抑制剂：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂，抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂和抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶D等的羧基蛋白酶抑制剂。其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类最多。根据序列同源性、半胱氨酸数目和分子中二硫键与作用位点之间的拓扑学关系，丝氨酸蛋白酶抑制剂又分为Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL（trypsin inhibitor like cysteine rich domain）等几个家族。目前，在家蚕的血液和丝腺等组织中发现的蛋白酶抑制剂主要以胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂为主。

蛋白酶抑制剂在许多生理过程例如消化、凝血、纤溶、补体级联反应、酚氧化酶级联反应、细胞迁移，激素或多肽释放等过程中起着重要的调控作用，但其作用的具体机理目前尚不清楚。近年来研究发现，家蚕血液中的蛋白酶抑制剂在抵御微生物入侵过程中起着重要作用。例如，家蚕C124品种的真菌蛋白酶抑制剂-F（FPI-F）可以抑制白僵菌孢子的萌发和萌芽管的生长，能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶以及白僵菌分泌到培养基中的蛋白酶粗提物。因此，可以从家蚕蛋白酶抑制剂中寻找能够有效对抗致病性真菌入侵的分子，以提高家蚕抗真菌能力。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于从家蚕蛋白酶抑制剂中寻找能够对抗致病性真菌入侵的分子，阐明其对抗致病性真菌入侵的机理，并提供其制备方法以及在生物学方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、蛋白酶抑制剂BmSPI38，由SEQ ID No.2中第23位至第80位氨基酸组成。

进一步，所述蛋白酶抑制剂BmSPI38在N末端还有信号肽序列，所述信号肽序列由SEQ ID No.2中第1位至第22位氨基酸组成。

2、编码蛋白酶抑制剂BmSPI38的基因。

进一步，由SEQ ID No.1中第137位至第313位核苷酸组成。

进一步，所述基因在5’末端还有信号肽编码序列，由SEQ ID No.1中第71位至第136位核苷酸组成。

进一步，所述基因cDNA全长序列由SEQ ID No.1中第1位至第388位核苷酸组成。

3、含有上述基因的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体以p28质粒作为基础载体，所述p28质粒由pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆位点序列如SEQ ID No.10所示。

4、含有上述重组表达载体的工程菌。

进一步，所述工程菌以大肠杆菌Origami 2(DE3)菌株为宿主菌。