[发明专利]一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌及检测方法

权利要求书

1.一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分离自内蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。

2.调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌的检测方法，其特征是包括下列步骤：

(I)、高效液相色谱用于短链脂肪酸的测定

(1)仪器和材料

Agilent1100液相色谱系统、Agilent色谱工作站、5μm，4.6mm×150mm的Zorbax SB-Aq色谱柱、水的电阻大于17MΩ的水净化系统、乙腈、甲醇、乙酸、丙酸、丁酸、浓度为0.015mol/L磷酸-磷酸盐缓冲液(pH＝2.5)；标样：浓度为0.1mol/L乙酸、丙酸、丁酸和浓度为0.01mol/L的混合样；

(2)粪便样品预处理

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取1mL浊液加4mL浓度为1mol/L的盐酸溶液振荡30s，离心(4500g)10min，取清液经0.45μm膜过滤待进样分析；

(3)色谱条件

流动相：甲醇和缓冲溶液的体积比为3∶97，所述缓冲溶液为浓度为0.015mol/L、pH＝2.5的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm，柱温为35℃，进样量为5μL。

(II)ELISA用于总胆汁酸的测定

(1)粪便样品预处理

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取5mL浊液，离心(8000g)10min，取1mL清液，离心20分钟(2000-3000转/分)，仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用；

(2)标准品的稀释与加样

在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉；稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为9μmol/L、6μmol/L、3μmol/L、1.5μmol/L和0.75μmol/L；

(3)加样

分别设空白孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，样品最终稀释度为5倍；加样将样品加于酶标板孔底部，晃动混匀；

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；

(6)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复多次并拍干；

(7)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(8)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

(9)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复多次并拍干；

(10)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(11)终止：每孔加终止液50μl，终止反应；

(12)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度，在加终止液后15分钟内进行。