[发明专利]一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

     本发明属于生物脱氮领域，具体涉及一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法。

背景技术

     好氧反硝化是指有氧气的条件下发生的反硝化现象，近些年来不断有好氧反硝化菌被分离出来（已报道的菌属有如副球菌属、假单孢菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属等50多个菌属存在好氧反硝化现象），这就为生物脱氮技术提供了一个新的途径。

好氧反硝化与传统的反硝化相比具有如下优点：

1、在有氧条件下进行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同时在一个反应器中进行，设备与操作成本大幅下降；

2、硝化作用的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化进程加快，缩短了脱氮周期。

所以，好氧反硝化脱氮技术是当前与以后一段时间内的科学研究的热点。

  芽孢杆菌属的特点：

1．细菌呈直杆状，细胞染色大多数在幼龄培养时呈G⁺，好氧或兼性厌氧，化能异氧菌，具有发酵或呼吸代谢类型；在条件不利的情况下形成芽孢，将自已保护起来，复活率高。其有耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压等，故以其开发产品有较高的稳定性

2．菌体生长营养要求简单。

3．有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对污染水体的有机物有较强的降解能力。       

综上所述，设计出一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，以利于快速分离、提纯出高效好氧反硝化的芽孢杆菌，以期为生物脱氮作贡献。

好氧反硝化菌的分离方法有很多，主要有：选择性富集法；稀释法；间歇曝气法。

 

发明内容

    本发明提供了一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，筛选出具有反硝化水体（水产养殖、与环境污染水体）中硝态氮与亚硝态氮的芽孢杆菌。

    为实现上述目的本发明采用如下技术方案：

一种简易、快速分离筛选好氧反硝化芽孢杆菌的方法，其特征在于：选择如土壤、池塘水样、 泥样或活性污泥等目标物接种于含有NO2^--N/NO3^—N的富集培养基中，进行间歇增氧富集培养；移取适量富集培养物75-80℃水浴杀除杂菌，稀释后涂布于含NO2^--N/NO3^—N梯度平板培养；然后对培养后的平板进行喷涂NO2^--N/NO3^—N显色液，挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌的作为初筛菌株；接着利用纯培养物菌体在不同NO2^--N/NO3^—N浓度的培养基中，恒温间歇增氧培养，测定其OD600nm吸光度值，以定量的确定芽孢杆菌所适应的NO2^--N/NO3^—N浓度范围；在确定的适中的NO2^--N/NO3^—N浓度下，用含有NO2^--N/NO3^—N的液体富集培养基，分别培养不同好氧反硝化芽孢杆菌，通过测定液体富集培养基中NO2^--N/NO3^—N含量，以求解其去除率，复筛出好氧反硝氧能力强劲的芽孢杆菌。

    所述的简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述的富集培养基：用的是LB培养基2.0-200.0 mg/lNO2^--N/NO3^—N；所述的LB培养基（g/l）:胰蛋白胨10.0，氯化钠5.0,酵母膏10，水1000ml,PH 7.2，121℃，灭菌25-30min。

本发明的有益效果：

目前现有技术在分离反硝化细菌多用BTB培养基，利用反硝化过程中碱的特性，利用培养基中BTB（溴百里酚蓝）指示剂在PH值＞7.6显示蓝色，来间接判断有反硝化细菌的有无。其培养基组份较复杂，且营养不全面，富集培养时间长，无针对性快速分离好氧反硝化芽孢菌缺点；利用本发明的方法，具有培养基组成简单（一般的化验室条件均有条件），营养全面，且有促生长因子故富集培养时间短，用针对性的显色剂喷涂，更直观。初筛中加入水浴环节能有效提高芽孢菌的检出率，大大降低在筛选目标菌株的工作量。应用定性与定量的方法相给合，使得工作效率更快。

总之，本发明方法具有简易、快速、直观、高效分离具有好氧反硝化能力芽孢杆菌的的特点，为生物脱氮技术提供了一个新的途径。