[发明专利]G蛋白偶联受体的分离提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术分离提纯G蛋白偶联受体的方法。

背景技术

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)是具有七次跨膜结构的细胞膜蛋白，它可以与激素、神经递质、光、气味等小分子物质发生相互作用，在细胞信号传递中发挥着重要作用。人类重大疾病的发生(如自身免疫性、传染性、过敏性疾病等)都与GPCRs功能紊乱有关。目前，三分之二以上的药物开发以及十分之一以上的世界前200种最畅销药物都是以GPCRs作为药物靶点(Cell.Mol.Life Sci.2006，63：1149-1164)。

尽管GPCRs作为药物开发目标蛋白的重要性已经非常清楚，但是关于它们原子级精细结构的了解却相对较少(Nature 2008，453：363-368；Science 2007，318：1266-1273)，这大大降低了结构依赖性药物设计的针对性。原因有二：(一)天然细胞或组织中GPCRs的含量很低，需要通过重组表达技术获得，然而将它们转运嵌入表达载体质膜的效率较低，加之它们对宿主细胞的毒害作用，增加了重组表达的难度。(二)由于膜蛋白的结构复杂，且稳定性较差，所以在提纯过程中需要添加去污剂以保持其结构和活性，这对GPCRs的产量造成一定影响，加之传统分离工艺的过程复杂、耗时较长，导致最终获得的高纯度蛋白质数量非常有限，仅达毫克级。

近年来，随着新型重组表达方法的建立，GPCRs的产量有了突破性增长，表达量可达10mg/L以上，但经传统工艺提纯后，GPCRs的损失极为严重，损失率高达90％(PLoS One2009，doi：10.1371/journal.pone.0004509)。所以，GPCRs的提纯技术已经成为研究其结构的主要瓶颈之一(Bri.J.Pharmacol.2006，147：S27-S37)。目前，急需开发操作条件更为温和的新型分离纯化技术来替代或部分替代GPCRs传统提纯工艺，以满足膜蛋白结构生物学研究发展的需要。

超滤膜是指膜孔径在1-100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化(Food Chem.2010，122：747-752)。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模(J.Membr.Sci.2010，352：231-238)。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，易于实现G蛋白偶联受体规模化制备的超滤提取方法。

本发明采取的技术路线是：

(1)将细胞膜或G蛋白偶联受体重组表达的工程菌菌体等，在表面活性剂浓度为0-5％(w/v)的缓冲液下破碎、增溶，离心取上清液；

(2)利用截留分子量为100-300kDa的超滤膜对步骤1得到的上清液进行超滤分离，截留液即为高纯度的G蛋白偶联受体产品。超滤分离条件为：表面活性剂浓度为0-5％(w/v)，溶液pH值2-10，离子强度0-1M。

本发明提取方法中，步骤(1)中的增溶时间为30分钟以上；步骤(1)中的离心条件为：4℃，离心力大于1000g，离心时间大于10分钟。

本发明具有操作简单，分离浓缩同步进行，且产品回收率高，可实现G蛋白偶联受体规模化制备等特点，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明。

实施例1，从基因重组的大肠杆菌中提取G蛋白偶联受体CCR3的方法，步骤：

(1)通过离心取250mL发酵液中的菌体，加入40mL的PBS缓冲溶液(50mM，pH8.0，表面活性Fos choline-14(FC-14)浓度为1.0％(w/v))，超声破碎1h，10000g离心30min，取上清液35mL；

(2)利用PBS缓冲溶液(50mM，pH8.0)将步骤(1)获得的35mL上清液稀释至面活性Fos choline-14(FC-14)浓度为0.02％(w/v)，得到1.75L稀释液；