[发明专利]猪组蛋白去乙酰化酶6的基因序列及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及猪组蛋白去乙酰化酶6的基因序列及该基因的用途，属于生物与新医药技术领域。

背景技术

在细胞内，存在着一种蛋白质翻译后修饰机制一乙酰化修饰，由蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)与组蛋白乙酰化酶(histoneacetylase，HAT)调节着组蛋白和非组蛋白的乙酰化平衡.HDAC促使底物蛋白去乙酰化，而HAT则相反。乙酰化平衡维持着细胞的正常增殖、分化和凋亡等生命活动，细胞内HDAC的高表达或异常募集将打破细胞内的乙酰化平衡，导致细胞异常增殖、分化受阻和凋亡抵抗，与肿瘤细胞的发生发展密切相关。新一代的分子靶向药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过抑制HDAC可以达到治疗肿瘤的目的。HDAC6属于II类HDAC。在哺乳细胞内HDAC蛋白家族不同类别的成员其功能侧重不同，所以参与肿瘤发生的机制也有差别。目前研究哺乳动物细胞主要存在四类HDAC，对I、II类的研究目前相对比较明确。I类HDAC，包括HDAC1、2、3、8，主要位于核内11，促使核小体的组蛋白去乙酰化而与抑制基因转录有关；II类HDAC，包括HDAC4、5、6、7、9、10，主要位于胞浆，负责细胞浆内大量非组蛋白的去乙酰化，介导蛋白质的降解及相互作用等功能改变。近年来越来越多的研究提示HDAC的非组蛋白乙酰化功能在肿瘤发生中扮演着更为重要的角色。

HDAC6作为最重要的II类HDAC，同时也是胞浆蛋白去乙酰化的关键酶，目前研究示在多个肿瘤细胞系高表达，可从侵袭素、泛素化等多个途径参与肿瘤的发生发展而令人瞩目。与其它HDACs不同，HDAC6是一种特殊的组蛋白去乙酰化酶，每个蛋白分子具有2个催化结构域，除了调控组蛋白的乙酰化水平外，其对胞质种微管蛋白的乙酰化水平同样具有调节作用。而微管蛋白与肿瘤细胞的迁移、病毒入侵时对细胞的调节具有重要作用。HDAC6在细胞质中通过影响细胞骨架相关蛋白以及Hsp90等蛋白的乙酰化水平，在多种细胞活动中发挥调节作用。HDAC6可以通过多种机制，发挥其广谱抗病毒活性，对多种病毒具有抗性并增强机体的免疫力：一方面，HDAC6可以通过对细胞膜内侧的细胞骨架的调节，影响细胞膜的动态性，抑制病毒包膜与细胞膜的融合，阻止病毒的入侵，另一方面，HDAC6还可以通过抑制病毒复制相关基因的转录，阻止病毒的包装过程；并促进病毒特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)清除被病毒感染的细胞，从而增强机体的抗病毒能力；除此之外，在病毒感染时，细胞内的HDAC6可以激活IRF3转录因子，促进β-干扰素基因的表达。研究表明，组蛋白去乙酰化酶6可以调控I型HIV病毒对人类细胞的感染能力(Agustin Valenzuela-Fernandez等，Molecular Biology of the Cell，2005)。

由于HDAC6具有抗病毒感染功能且猪的HDAC6目前仍没有公开的完整的编码序列，其是否对提高猪的抗病毒感染能力有作用尚不清楚。因此，我们首次克隆了猪HDAC6基因的编码序列的，并对其催化功能进行了验证。我们将此基因序列连接到真核生物过表达载体，实现了在动物细胞内的稳定表达。此基因有望成为提高猪的抗病毒感染能力和研究肿瘤迁移机制和药物靶点方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明是一种猪组蛋白去乙酰化酶6的基因序列及其用途。

该发明提供的方法是通过已知物种的HDAC6序列的同源性比对，在mRNA的保守区域设计兼并引物，分段克隆后将测序结果拼接后，获得猪HDAC6的完整编码序列。通过构建此基因的过表达载体和细胞转染，使此基因能够在动物细胞内稳定表达，可以发挥其去乙酰化酶活性。该基因序列与小鼠和人的HDAC6序列具有75％以上的DNA序列和蛋白序列同源性。

其中，所述哺乳动物细胞可以是成纤维细胞或胚胎干细胞。

所述基因序列的克隆引物和去乙酰化酶活性应用也属于发明的保护范围。

附图说明

图1为猪HDAC6的分段克隆和全长克隆引物。

图2为猪HDAC6的分段克隆和全长克隆的DNA电泳图。

图3为pEF-1α启动子表达porcine HDAC6+EGFP的载体结构示意图。

图4为猪HDAC6在小鼠ES细胞内的过表达和功能检测情况。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。

引物合成及序列测定由invitrogen(北京公司)完成。

反转录试剂盒和lipo转染试剂购于invitrogen公司。