[发明专利]反胶束萃取纯化木质素过氧化物酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种萃取纯化酶的方法，尤其涉及一种反胶束萃取提纯木质素过氧化物酶的方法。

背景技术

木质素是由苯丙烷结构单元组成的复杂的近似球状的芳香族高聚体，其降解难度减缓了地球上碳循环的速度。木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase，LiP)、锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)构成木质素降解体系，研究表明，LiP在木素降解中起关键作用。此酶具有广泛的底物范围和极强的氧化能力，利用该酶降解各种污染物已成为当今世界环境污染治理的研究热点。目前，LiP的纯化方法多采用盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析，这些方法存在操作时间长，不易放大等缺点。反胶束纯化技术弥补了这些缺点，且具有成本低，可以重复利用等优点，有广阔的工业应用前景。

反胶束是溶解在有机溶剂中的表面活性剂在超过临界胶束浓度时自发形成的聚集体。当含反胶束的有机溶剂和蛋白质水溶液接触时，蛋白质在静电作用和疏水作用下进入有机相，然后再调节适当的条件，使蛋白质从有机相重新反萃取到水相中，以达到纯化的目的。在萃取过程中，可以通过改变pH、离子强度、表面活性剂种类和浓度等因素实现对目标酶的选择性萃取。因此，萃取条件对纯化效果有着至关重要的作用。目前，反胶束萃取技术局限于应用化学表面活性剂，常用的化学合成表面活性剂在酶催化反应过程中与酶蛋白表面易产生强烈的静电相互作用，使酶蛋白易变性失活，从而降低酶催化作用的有效性，阻碍了反胶束萃取纯化酶的进展。因此，开发一种更好的萃取纯化酶的方法成为蛋白质及酶制备的一个重要内容。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种环保安全、操作简便且成本低的反胶束萃取纯化木素过氧化物酶（LiP）的方法。 

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种反胶束萃取纯化木素过氧化物酶的方法，包括以下步骤：

（1）配制反胶束溶液：配制包括生物表面活性剂、异辛烷和正己醇的反胶束溶液，其中所述生物表面活性剂为鼠李糖脂；

（2）前萃过程：将配制好的木质素过氧化物酶粗酶液与所述反胶束溶液混合，（磁力）搅拌，离心后静置分相，留取上层有机相；

（3）后萃过程：将所述上层有机相与缓冲液混合，（磁力）搅拌，离心后静置分相，留取下层水相，得到纯化后的木质素过氧化物酶溶液。

分别测定所述下层水相中的蛋白质萃取率（EE%）和LiP酶活回收率（AR%），并分析所述下层水相及所述下层水相中粗酶液的成分。

上述的技术方案中，反胶束溶液中生物表面活性剂的浓度优选为2.75 mmol/L～3.0mmol/L；所述反胶束溶液中正己醇与异辛烷的体积比优选为1∶1～1∶1.2。

上述的技术方案中，所述木质素过氧化物酶粗酶液优选是由黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）经培养发酵后制备得到。更优选的，所述培养发酵的过程具体包括：在高压灭菌后的液体发酵培养基中接种黄孢原毛平革菌孢子，每升所述液体发酵培养基中接种的孢子数为4×10⁸～5×10⁸个，37℃～38℃温度、150r/min～180r/min转速下摇床培养6～8天，除去所得培养液中的孢子和菌丝，离心处理后即得木质素过氧化物酶粗酶液。

优选的，所述步骤（2）的前萃过程中，所述木质素过氧化物酶粗酶液的pH值为3.0～3.5，所述木质素过氧化物酶粗酶液中还含有浓度为0.04mol/L～0.045mol/L的KCl溶液。

所述步骤（2）的前萃过程中，所述木质素过氧化物酶粗酶液与所述反胶束溶液是按1∶1～1∶1.2的优选体积比混合。

优选的，所述步骤（3）的后萃过程中，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为6.0～6.5，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中还含有浓度为0.5mol/L～0.55mol/L的KCl溶液。

所述步骤（3）的后萃过程中，所述上层有机相与所述缓冲液是按1∶1～1∶1.2的优选体积比混合。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）采用反胶束技术只需前萃和后萃两步就可以达到萃取纯化的目的，步骤简单，操作方便。

（2）萃取纯化LiP酶活回收率高，纯化程度高。

（3）纯化结果可以通过有效测定和分析得到证实。