[发明专利]免疫亲和沉淀法纯化抗体

说明书

技术领域

本发明是一种免疫化学方面的抗体纯化新方法，主要涉及免疫化学的研究和医药卫生的生产领域。

背景技术

在许多免疫化学的研究和医药卫生的生产过程中，常常需要免疫亲和层析级别的纯化抗体。为了得到亲和力好、特异性强、纯度高的抗体，现在常用的纯化方法是免疫亲和层析法。免疫亲和层析法的过程是：一般情况下，先用偶联剂溴化氰(CNBr，有剧毒，操作时需要防护)将抗原连接到固相载体——琼脂糖凝胶(Sepharose 4B或6B)上作为免疫吸附剂，然后将免疫吸附剂装入层析柱中，用淋洗液洗去未被连接的抗原和连接剂后，即可上样待纯化的抗体混合物，当混合物中的抗体与免疫吸附剂上连接的抗原靠近时，抗原抗体会产生特异性结合，形成抗体-免疫吸附剂结合物，从而将需要纯化的抗体暂时地特异固定在免疫吸附剂上，混合液中的其他组份则游离在液相中，充分反应后，淋洗除去未结合的其他混合物，淋洗完的层析柱上只留下单一的抗体-免疫吸附剂结合物，最后，再通过改变pH值，解离抗原和抗体的结合，从而洗脱下亲和力好、特异性强、纯度高的抗体。

免疫亲和层析法用于纯化抗体时存在的缺点：①制备免疫吸附剂时，要使用偶联剂溴化氰，该化合物有剧毒，操作时要特殊防护；②经活化的琼脂糖凝胶比较昂贵，生产制备时购置成本高。

发明内容

本发明采用免疫亲和沉淀法纯化抗体：首先，采用以丙烯酰胺和丙烯酸为单体的共聚物固相微球(该微球是圆球状，直径为2～5μm，可悬浮于水溶液中)作为固相载体，这种固相载体上含有羧基(-COOH)，将含有氨基(-NH₂)的抗原与固相载体混合，再加入偶联剂——1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，室温震荡反应过夜，EDC能使羧基和氨基脱水形成酰胺键，从而将抗原连接到固相载体上，形成了抗原-固相载体的免疫吸附剂。通过离心洗涤，除去未被连接上的抗原和其他混合物后，得到单一的免疫吸附剂。然后，将待纯化的抗体原液与免疫吸附剂混合，2～8℃放置过夜，抗原抗体产生特异性结合，形成抗体-免疫吸附剂结合物，通过离心洗涤，除去未结合的其他混合物，得到单一的抗体-免疫吸附剂结合物，再降低体系中的pH值，则抗体就会被解离到溶液中，通过离心分离上清后立即用碱性溶液调整上清液的pH值到中性，此上清经透析后即为纯化的抗体溶液。免疫吸附剂通过离心洗涤后悬浮于免疫吸附剂保存液中，2～8℃放置，可重复用于纯化抗体。免疫吸附剂保存液的组份为：0.02M PB(磷酸盐缓冲溶液，pH7.4)、0.9％NaCl、0.1％NaN₃。

本发明所用的固相载体制备成本低。抗原和固相载体的偶联剂是碳二亚胺(EDC)，无毒性。连接过程为室温震荡过夜，非常简便。抗体的纯化过程，采用的是最常用的离心方法，一次可大批量制备。而且，免疫吸附剂经纯化抗体后，还可重复使用，2～8℃下也可长期保存。所以，本发明建立了一种操作简便、不操作剧毒物、制备成本低廉、适合大量生产、可用于制备纯度达到免疫亲和层析级别抗体的方法。

本发明操作步骤如下：

1、抗原的准备：用于本发明的抗原需要有氨基(-NH₂)，一般的蛋白质抗原都有氨基，经过纯化后即可使用。

2、固相载体的准备：固相载体在偶联前，一般需要先用0.01MPB(pH7.4)的缓冲液离心洗涤3次，用以除去悬浮液中的杂物。本发明中的通用离心条件为：离心机转速要求不小于每分钟3500转，离心时间不小于10分钟，洗涤时每次用不小于10倍固相载体体积的0.01MPB(pH7.4)的缓冲液。

3、固相载体与抗原的连接：将固相载体和抗原(加入前测抗原的浓度)共同混合于0.01MPB(pH7.4)的缓冲液中，再加入EDC的水溶液，于室温下震荡反应过夜。因为固相载体上含有羧基，羧基在EDC的作用下可与抗原上的氨基共价连接，从而使得固相载体和抗原产生稳定的共价连接形成了免疫吸附剂。固相载体与抗原连接后，离心，测上清抗原浓度，从而可计算免疫吸附剂上连接的抗原量。然后，再对免疫吸附剂离心洗涤至上清A_280nm(溶液在280nm紫外光下的光吸收值)＜0.02。洗涤完后，免疫吸附剂用等体积左右的0.01MPB(pH7.4)的缓冲液悬浮。

4、免疫吸附剂与抗体的结合：取一定体积的待纯化抗体原液直接加入到免疫吸附剂悬浮液中，2～8℃放置过夜。次日，离心，沉淀物即为抗体-免疫吸附剂，除去上清，将抗体-免疫吸附剂离心洗涤至上清A_280nm＜0.02。