[发明专利]一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法

权利要求书

1.一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法,包括：

1) 将番茄黄化曲叶病毒TYLCV的V2基因和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体；

2) 利用农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体；

3) 转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种或携带TYLCV的烟粉虱接种鉴定抗病性，获取抗TYLCV番茄。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

1) 分别利用下列两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从有TYLCV典型症状的番茄植株病叶样品DNA中扩增V2基因和C1基因，所述V2基因和C1基因的序列分别为SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示；

F1 CAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCT

R1 AACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGG

F2 GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGC

R2 GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG

2) 将SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2 PCR产物混合，以引物F1和R2进行PCR扩增,得到V2和C1的嵌合基因，序列为SEQ ID NO.3所示，嵌合基因SEQ ID NO.3 PCR产物与pGEM-T 载体连接，得到T-V2C1；

3) 以T-V2C1为模板，利用下列F3/R3引物进行PCR扩增，将PCR产物和植物表达载体iHp用BamHI和HindIII酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp-T-V2C1；

F3 CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCA

R3 TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG

4) 以T-V2C1为模板，利用下列F4/R4引物进行PCR扩增，将PCR产物和iHp-T-V2C1以XhoI和SacI酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp-V2C1；

F4 GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTG

R4 GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA

5) 用BamHI和SacI酶切植物表达载体pBI121和iHp-V2C1，回收酶切的目的片段，用T4-DNA连接酶连接，构建RNAi载体pBI121-V2C1；

6) 农杆菌介导法将RNAi载体pBI121-V2C1转化番茄无菌苗的子叶或下胚轴外植体，通过硫酸卡那霉素筛选，抗性再生苗生根、移栽，PCR鉴定获取转基因番茄；

7) 将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆采用农杆菌注射法对4-6叶期苗龄转基因番茄进行注射接种，筛选抗TYLCV转基因番茄；或者将转基因番茄植株置于防虫温室，通过携带TYLCV的烟粉虱进行捕食和传毒，筛选抗TYLCV转基因番茄。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述转基因番茄含有SEQ ID ID NO.3所示的部分或全部核苷酸序列。