[发明专利]一种分泌抗菌肽的乳酸链球菌基因工程制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说涉及一种重组抗菌肽，其基因工程乳酸链球菌的制备和应用。

背景技术

由于人类对抗生素的过度滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，不断困扰着畜牧养殖业并引发食品安全问题。

抗菌肽是生物体内在防御外源病原体入侵时产生的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除具有广谱抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还有抗肿瘤细胞作用和免疫调节作用，在医药卫生、农业生产、食品工业等领域具有广泛的应用前景。抗菌肽作用机制独特，不易产生耐药菌，被认为是传统抗生素替代品。

目前，国内外宣传的抗菌肽制备方式多种多样，有人用利用大肠杆菌、病毒、酵母、植物细胞、昆虫和哺乳动物细胞等重组表达系统来表达抗菌肽(专利ZL96100376.6和专利ZL200810132258.1；天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究，黄亚东，中国抗生素杂志，28：304-307，2003)。这些表达系统本身也有不足：抗菌肽自身对病原菌具有抑制和杀灭作用，这就难以用原核生物中的大肠杆菌做为表达系统；使用病毒表达系统存在实验步骤繁琐，条件不易控制；抗菌肽对真核细胞没有抑制作用，但多细胞真核表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点。这些都很难实现大规模的工业生产。酵母表达系统作为单细胞真核表达系统，遗传背景清楚，被应用于工业生产，常被应用的酵母有毕赤酵母和酿酒酵母。

但是，毕赤酵母并不是常见的食用菌，这就限制了其广泛的应用；酿酒酵母是食用菌，但不是动物机体内的天然益生菌群，而乳酸菌在自然界和人畜消化系统中广泛存在，目前发现200多种，其中绝大部分都存在于人体及动物的肠道，是机体必不可少且具有重要生理功能的菌群。市面上也不缺乏动物用乳酸菌制品，它们主要的功用在于促进免疫调节，增强机体对肠道感染的抵抗能力，减少腹泻。

总之，制备分泌其他物种来源的抗菌肽的乳酸链球菌，不仅可以得到高效的抗肿瘤、抗炎症、调节免疫功能的保健型产品，而且能够达到绿色无残留，安全可靠的标准，易应用于大规模生产，并可以从源头上解决滥用抗生素给养殖业、生态环境和人类健康带来的严峻问题，有效解决当前抗生素引起的食品安全和污染问题

发明内容

本发明旨在提供一种分泌抗菌肽的基因工程乳酸链球菌的制备方法，该方法获得的乳酸菌与抗菌肽复合产品，成本低，具有高效活性，易于实现产业化。

本发明所述的一种分泌抗菌肽的基因工程乳酸链球菌的制备方法，其操作步骤为：

1)：抗菌肽的基因扩增

设计合成上下游引物，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位点，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位点，以AMP的重组质粒为模板，通过PCR扩增，获得抗菌肽基因片段；或者直接合成已知的抗菌肽cDNA序列，再通过PCR扩增获得抗菌肽基因片段；再或者从生物组织或细胞中提取RNA进行RT-PCR扩增获得抗菌肽基因片段。

2)：抗菌肽的基因克隆和测定

将抗菌肽基因扩增后，回收PCR产物，用T4连接酶与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经抗性培养基筛选、测序后，获得最终获得阳性重组质粒pMD18-T：AMP。

3)：乳酸链球菌表达载体的构建和转化

扩大培养阳性转化子并抽提重组pMD18-T：AMP质粒，分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切重组质粒和乳酸链球菌穿梭质粒pAR1411。回收酶切产物，用T₄DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pAR1411：AMP，用电转的方法转入乳酸链球菌L.lactis subsp.cremoris MG1363，通过抗性培养基(GM17+0.5M琼脂，红霉素)筛选阳性转化子MG1363/AMP。

其表达框为P32-AMP-TT，其中P32为启动子，TT是终止子。

4)：重组乳酸链球菌工程菌扩大培养和抗菌肽的鉴定

将筛选的阳性转化子MG1363/AMP，在GM17液体培养基中扩大培养，24-48h后，收集菌液，离心取上清，浓缩，然后Tricine-SDS-PAGE鉴定抗菌肽蛋白的表达情况；并且进行抗菌肽的抗菌活性测定。

本发明的有益效果在于：

1.本发明所采用的表达系统安全，表达量高，稳定性好。表达的抗菌肽为组成型分泌表达，细胞培养过程无需额外添加有毒诱导剂，绿色安全；