[发明专利]泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析和基因工程抗体技术领域，具体涉及一种能同时检测泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体，同时还涉及一种泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体的制备方法，还涉及一种泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体的用途。

背景技术

大环内酯类抗生素是动物生产中常用的抗菌促生长药物，在兽医上广泛用于治疗兽禽支原体和革兰氏阳性细菌所致的感染性疾病；在畜牧生产上广泛用做饲料添加剂，促进动物生长和预防疾病。我国是世界第一大大环内酯类抗生素的生产国，该类药物的乱用，滥用现象广泛存在。

泰乐菌素和替米考星是动物专用抗生素，是动物生产过程中使用最广泛的大环内酯类药物。该类药物的滥用，很容易使人类对其他人用大环内酯类药物产生耐药性，影响疾病治疗。我国制定了泰乐菌素和替米考星的在动物可食性组织的最高残留限量。建立简便，快速的检测方法有利于控制该类药物的残留。酶联免疫分析方法具有快速，简便，高通量和低成本的特点。

抗体是酶联免疫分析方法的核心内容。目前用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗体，其制备必须通过免疫动物、细胞培养等获得。整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作。基因工程抗体是指将抗体的重链和轻链可变区基因通过特定的方式连接，在其他种属进行高效表达。在大肠杆菌体内表达抗体具有低成本，高产量的特点。

申请人在2007年公布了泰乐菌素和替米考星残留检测用单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒(专利号：ZL 200710052663.8)。在该发明中并未公布特异性识别泰乐菌素和替米考星单克隆抗体可变区的氨基酸和核苷酸序列以及基因工程抗体检测泰乐菌素和替米考星的方法。本发明采用ZL 200710052663.8中的CCTCC NO：C200719杂交瘤细胞株P3C4为材料，采用RT-PCR方法扩增所有抗体基因的重链和轻链可变区序列，进一步拼接成单链抗体序列，将单链抗体基因插入特异性的噬菌体展示载体，结合噬菌体展示和体外特异性筛选技术，获得能特异性识别泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体以及抗体的重链和轻链可变区序列，通过大肠杆菌表达系统制备基因工程抗体，建立ELISA检测方法，藉此探究基因工程抗体在兽药残留检测中的应用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体，该基因工程抗体有利于建立更加经济快捷的泰乐菌素和替米考星残留ELISA检测方法及试剂盒；有利于阐明抗体与药物的识别机理；还可应用于其它小分子药物抗体的制备。

本发明的另一个目的是在于提供了一种泰乐菌素和替米考星基因工程抗体的制备方法，方法易行，操作简便，该方法采用原核表达系统，可便于基因工程抗体的大批量生产。

本发明的再一个目的是在于提供了一种泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体在动物源性食品的泰乐菌素和替米考星残留检测中的应用，能广泛应用于动物可食性组织中泰乐菌素和替米考星的残留检测，准确提供动物可食性组织中泰乐菌素和替米考星的残留量信息。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明通过抗体重链轻链可变区基因的体外扩增和拼接，结合噬菌体表面展示和体外筛选技术，获得具有特定功能的单链抗体；并建立相应的ELISA检测方法。

一种泰乐菌素和替米考星的基因工程抗体的制备方法，其步骤是：

A、取液氮保存的杂交瘤细胞株P3C4(CCTCC NO：C200719)，Trizol一步法提取脾细胞总RNA，纯化得到mRNA，在逆转录得到cDNA。

B、以此为模板，分别扩增得到重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因；以重链和轻链抗体片段互为引物，利用多肽链(Gly₄Se)₃将抗体重链和轻链连接为scFv。

C、将酶切scFv连接入E.coli TG1中，加入M13K07培养，经反复筛选，得到能展示泰乐菌素和替米考星特异性抗体的噬菌体抗体文库。

D、将此噬菌体加入到处于对数生长期的E.coli HB2151中(购自杭州远方生物)，IPTG诱导，得到特异性噬菌体抗体。