[发明专利]一种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法

说明书

技术领域

本发明属于显微组织切片技术领域，具体涉及一种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法。

背景技术

植物维管束系统由韧皮部和木质部组成，是贯穿整个植株体内的主要输导组织，承担着植株体内的长距离运输，是植物输送光合产物、水分和矿质营养的通道。韧皮部组织由筛管、伴胞和薄壁细胞组成，韧皮部筛管中含有胼胝质、胼胝质合成酶、韧皮蛋白等多种物质，在筛管的代谢中起着重要调节作用。胼胝质（callous）（主要成分为β-1,3-葡聚糖）的合成、分解直接关系到植物正常的生长代谢过程，在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用。研究表明，机械损伤、病原菌侵染、害虫为害等外界逆境胁迫可诱导植物细胞合成胼胝质(Jaffemet al,1984)，而且胼胝质的积累与植物抗病、抗虫特性有关（田国忠等，1994；Ecaleet al., 1995,1999；Serranoet al.,1998）。

植物组织切片方法种类多，每一种切片法都各有特点和局限性，常用有徒手切片法、石蜡切片法、冷冻切片法等。徒手切片法即用剃须刀切割材料，难以切得很薄、易产生厚薄不匀现象，难以获得完整的切片；石蜡切片法虽是最常用的方法，但由于材料切片前需经过固定、脱水、透明和包埋等一系列步骤，易使材料变脆、变硬和变形，过程繁琐、周期长；冷冻切片法是利用冷冻切片机使材料冷冻后进行切片的一种快速方法。

目前，植物组织中胼胝质的检测常用苯胺蓝染色法(李师翁等, 1990; Adrienne et al., 2005; Penet et al., 2005； 申业等, 2006；丁新伦等，2008)，也有用改良苯酚品红-苯胺蓝压片法（刘晓瑞等，2008）, 主要观察植物叶片组织受病虫害等逆境胁迫后和植物小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质的动态变化。丁新伦等（2008）采用徒手切片法及苯胺蓝荧光染色技术研究了水稻条纹病毒（RSV）胁迫下抗、感水稻品种叶片中胼胝质沉积的影响。所用方法为：对稻苗叶片组织做徒手切片，再在96%乙醇中浸泡过夜,置于磷酸缓冲液（0.07mol/L, pH=9）中30 min，用0.005%苯胺蓝(0.07mol/L, pH=9)染色60 min,20%甘油封片，最后在Olympus荧光正置显微镜下用紫外光激发观察。但徒手切片难以切得很薄、易产生厚薄不匀现象。由于水稻叶片组织与叶鞘组织中含水量不同，而且叶鞘组织的细胞腔大而壁薄，取样后叶鞘组织中常有气泡存在，无法用徒手切片，切片易破碎不完整，难以获得完整的组织结构。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于观察叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法的技术方案。

所述的一种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）材料前处理：取分蘖期的水稻叶鞘组织，洗净擦干后迅速用刀片切成0.3～0.5 cm的小段，然后立即放入10%的甘油溶液中，并用真空泵抽气10～20 min，直至叶鞘组织下沉为止；

2）样品固定：在冷台底座先加1滴组织冷冻胶，再将步骤1）得到的叶鞘组织小段垂直置于平放的冷台上，再加2～5滴组织冷冻胶将叶鞘组织小段完全包裹住，并放在冷冻切片机中的样品台上，放置100～140 min后，即可用于冷冻切片；

3）冷冻切片：将粘有叶鞘组织小段的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上，拧紧固定螺丝，并将切片厚度调节旋钮调至切片厚度10μm，箱体最低控制温度为-40℃，切片头最低控制温度为-50℃，摇动旋转手轮进行切片；

4）展片：先将载玻片靠近切片刀，每切一张切片，用毛笔轻轻地将切片移到载玻片上，每块载玻片贴上15～20张切片；

5）染色：贴好切片后，在室温下让冷冻胶稍稍干燥，放入96%酒精浸泡6～10小时后，取出并将酒精晾干，再加入1 ml浓度为1/15 mol/L、pH值为7.0的磷酸缓冲液于切片上，45 min后再加1 ml浓度为0.1 mol、pH值为7.0的苯胺蓝染色液，染色60 min后将载玻片缓慢倾斜倒掉染色液；

6）显微观察与拍照：待切片刚刚干燥时，立即在Olympus BX51荧光正置显微镜下用紫外光激发观察到叶鞘组织中的胼胝质，并用该显微镜专用的照相机进行拍照。

所述的一种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法，其特征在于所述的步骤1）中真空泵为SHZ-CA型循环水式多用真空泵。