[发明专利]一种用于孔雀石绿快速检测的分子印迹-SPR传感方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于分子印迹膜材料作为识别元件的表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)传感方法用于检测孔雀石绿，特别涉及于SPR芯片表面原位合成分子印迹膜的方法。

背景技术

孔雀石绿(C₂₃H₂₅ClN₂)属于三苯甲烷类染料，为具有金属光泽的结晶体，极易溶于水，在细胞分裂时阻碍蛋白肽的形成，从而产生抗菌杀虫作用，被作为杀菌剂、驱虫剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类。在鱼类饲养中一般用于防治水霉病、烂鳃病以及寄生虫病等。研究表明孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸和致突变作用。1993年美国FDA已经将孔雀石绿列为优先研究的致癌性化学物质，其在体内代谢缓慢，代谢产物中的无色孔雀石绿在动物体内至少在一周内是稳定不变的。由于孔雀石绿的这些危害，各国已制定法规禁止将孔雀石绿用于水产养殖。美国、日本以及英国等许多国家已禁止将其用于水产养殖业。《中华人民共和国农业行业标准无公害食品渔用药物使用准则(NY5071-2002)》中已将孔雀石绿列为禁用药物。但是由于孔雀石绿在水产养殖中抗菌效果较好、价格低廉，仍被部分非法商贩违法使用，因此对于孔雀石绿的检测、监控格外重要。近几年我国因药物残留问题导致出口的动物性食品屡遭禁运，2006年初我国出口韩国的鳗鱼由于孔雀石绿检测超标，使我国渔业遭受巨大经济损失，欧盟等国家和地区多次强烈要求我国政府对孔雀石绿残留进行监控。因此，建立孔雀石绿残留的检测方法十分迫切并具有重要的现实意义。

目前孔雀石绿的检测方法主要是高效液相色谱法、液质联用法、光谱分析、酶联免疫法和电化学分析等。在这些方法中，液质联用与酶联免疫法较为常用，其中液质联用灵敏度高效果好，但设备昂贵，检测成本高；而尽管酶联免疫法快速、灵敏、特异高，但是所用的抗体制备困难且只在尘理条件下稳定。SPR传感检测方法是基于表面等离子体共振原理的光学方法，通过其芯片表面敏感识别元件对目标物的识别和吸附，产尘传感信号，具有无需标记、快速、灵敏、对样品无损的优势，具备开发成一类现场快速检测技术的潜在条件。但目前常用的敏感识别元件为抗体和酶等尘物材料，检测成本较高和贮存时间短。而分子印迹材料作为一种人工合成的聚合物材料，可对目标物特异性吸附和分离，被称为“人工抗体”，并且易于制备、成本低、环境耐受性好。通过在SPR传感器芯片表面原位聚合制备分子印迹膜，建立分子印迹-SPR传感检测方法，其关键步骤是分子印迹膜的制备及其在SPR传感器芯片表面的固定。

发明内容

本发明的目的是提供一种分子印迹-SPR传感方法用于检测孔雀石绿。

本发明的第二个目的是提供一种在SPR传感器芯片表面原位聚合分子印迹薄膜的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种在SPR芯片表面热引发原位聚合孔雀石绿分子印迹薄膜的方法，具体步骤如下：

(1)将聚合引发剂和粘附剂溶解于适当有机溶剂中，经匀胶仪旋涂至SPR芯片(石英基质表面镀有50nm金膜)表面，通过调节溶液浓度控制膜厚度；

(2)将经步骤(1)修饰的SPR芯片浸入含有模板分子、功能单体和交联剂的预聚合液中，除氧后60℃引发聚合16小时，经过洗脱模板分子，制得固定在SPR芯片表面的分子印迹薄膜，可对模板分子孔雀石绿特异性吸附，原子力扫描电镜测定膜厚度。

所述引发剂优选为偶氮二异丁腈、过氧化二碳酸二(2-乙基己基)酯、2，2′-偶氮二(2-咪基丙烷)二盐酸盐和偶氮二异丁基脒盐酸盐。

所述粘附剂优选为聚氯乙烯、氯化聚氯乙烯、聚乙烯。

所述功能单体优选为丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡啶。

所述交联剂优选为N，N′-亚甲基二丙烯酰胺、二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、3.5-二(丙烯酰胺)苯甲酸。

一种基于分子印迹膜作为识别元件的SPR传感器检测孔雀石绿的方法，具体步骤如下：

(1)配置系列浓度的孔雀石绿溶液，对所制备的分子印迹膜在SPR传感器上进行吸附响应测试，绘制孔雀石绿浓度与SPR信号响应的标准曲线，计算方法线性范围及最低检测限。

(2)以非印迹膜和引发剂膜为对照，在相同条件下进行吸附测试实验，验证所制备分子印迹膜的吸附性能。

(3)选择结晶紫、甲基紫、阴性孔雀石绿、亚甲基蓝和己烯雌酚作为类似物，进行分子印迹膜特异性测试。

(4)利用建立的检测方法，连续多次对同一浓度的孔雀石绿溶液进行检测→再生→检测，测试所制备分子印迹膜的再尘性能。