[发明专利]肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的冻干保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肝素酶I、II、III的冻干保存方法，尤其涉及一种由氯化钙和海藻糖组成的保护剂，用于冻干过程中肝素酶I、II、III的活性保护。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分别是分子量大约43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9.0左右，应用和研究非常广泛。

肝素酶是一种很容易失活的酶，Daniel等[Daniel etal，(1992)J.Bio.Chem.267(34)24347-24355]简述了对纯化的三种肝素酶做的稳定性研究，肝素酶I溶液在4℃短期保存即失活50％，而经过一次冷冻融化或冻干融化，只能分别保留45％和25％的活性。肝素酶II经过一次冷冻融化或冻干融化，都可保留大约75％活性。肝素酶III溶液在4℃短期保存基本不失活，而经过一次冷冻融化或冻干融化，只能保留20％到30％的活性。

给肝素酶I溶液中添加2mg/ml牛白蛋白，可在三种处理条件下保持85％以上的活性，而加入5％的半乳糖，则能保留40-80％的活性。肝素酶II溶液中即使添加了所述两种保护剂，也基本无促进效果。添加牛白蛋白，可使肝素酶III活性收率提高20-25％，但添加半乳糖反而使活性更加不稳定。

对于需要保持生物活性的酶类物质的保存和使用，冻干粉是一种很有效的方法。干燥的酶类一般具有更高的稳定性，也方便运输。但是酶类一般都对热敏感，所以需要采用冷冻干燥法。先将待干燥的酶液在低温下冻结，然后低温抽真空让水分由固体状态直接升华为水蒸气并从酶中排除而实现干燥。但是在酶冻结过程中有些比较脆弱的酶仍会发生失活现象，需要加入某种保护剂，比如海藻糖、蔗糖、白蛋白、明胶等。不同的保护剂适用于不同的酶。

对肝素酶做冻干保护的研究报道可检索到的很少，主要在Daniel等[Danieletal，(1992)J.Bio.Chem.267(34)24347-24355]的研究中，但给出的信息也不全面，有些结果也与我们的结果有差异。其中肝素酶I在没有保护剂的情况下经过一次冻干融化保留25％的活性的结果与我们的实验结果接近(33.8％)。肝素酶II经过一次冻干融化保留75％活性的结果则与我们的实验结果(38.3％)相差较大。肝素酶III经过一次冻干融化保留30％活性的结果与我们的实验结果接近(47.2％)。

本发明给出一种以氯化钙和海藻糖为内容的冻干保护剂，用于将肝素酶I、II、III冻干，在保护剂作用下维持了较高的活性。这样制得的酶冻干粉便于储存、运输、使用，提高了应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素酶I、II、III的冻干保存方法，尤其涉及一种由氯化钙和海藻糖组成的保护剂，用于冻干过程中肝素酶I、II、III的活性保护。该方法可对3种酶的冻干起到显著保护作用，冻干粉复水后肝素酶I的活性回复率为73.9％(对照为33.8％)，肝素酶II的活性回复率为98.8％(对照为38.3％)，的活性回复率为77.4％(对照为47.2％)。

在本发明的第一方面，本发明提供了肝素酶I和/或II的冻干保存方法，包括下述步骤：

步骤1、制备肝素酶I、II溶液，采用Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述肝素酶的溶剂；

步骤2、制备保护剂溶液：制备海藻糖溶液以及任选的氯化钙溶液，或者二者的混合溶液，采用Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述保护剂的溶剂；

步骤3、将步骤2中获得的保护剂溶液和步骤1中获得的肝素酶I和/或II的溶液的混合；

步骤4、将混合液冻干。

在本发明的第二方面，本发明提供了肝素酶III的冻干保存方法，包括下述步骤：

步骤1、制备肝素酶III溶液，采用Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述肝素酶的溶剂；

步骤2、制备保护剂溶液：制备海藻糖溶液，采用Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述保护剂的溶剂；