[发明专利]一个核酸适配子筛选文库

说明书

技术领域

本项发明属生物分析与工程技术领域，具体涉及一个自行设计的用于核酸适配子筛选的随机单链寡核苷酸文库及其配套的引物。

背景技术

核酸适配子（aptamer）是一种生物分子的人工单链核酸配体，通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子与抗体的功能相似，可用于靶分子的识别，且敏感性和特异性可优于抗体。在两者的制备过程中，核酸适配子在靶标方面有明显的优势。筛选适配子的靶标可以小到无机分子，大到完整的活细胞，甚至组织，而制备抗体的靶标主要为蛋白质，且必须具有免疫原性，还不能有毒。因而两者所针对的靶分子范围相差甚远。不仅如此，核酸适配子的制备过程本身也较抗体更简单、不需要体内过程、耗时更短、可人工合成。此外，从核酸适配子与抗体之间理化性质的差异也可看到核酸适配子的优势，如性质稳定、无免疫原性、分子量较小。因而核酸适配子的筛选与应用已涉及医学的各个领域，包括基础研究、临床诊断、疾病治疗和药物研发等方面。

SELEX技术是一种组合化学新技术，自1990年问世以来受到广泛关注，发展迅速。它利用人工合成的大容量随机单链寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出能与靶分子特异结合的单链寡核苷酸，并借助PCR扩增技术使之指数富集，最终获得能与靶分子高特异性、高亲和力结合的核酸适配子。核酸适配子的SELEX筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核苷酸文库及配套的引物；将靶标与文库共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核苷酸与靶标形成复合物，分离后者并洗脱寡核苷酸；以洗脱的寡核苷酸作为模板进行PCR扩增，制备出新的单链随机寡核苷酸文库（亚文库），开始下一轮筛选；通过重复数轮筛选与扩增，能与靶标高特异性和高亲和力结合的寡核苷酸留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端固定序列与文库相符的寡核苷酸即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出特异性强、亲和力大的核酸适配子应用于靶标的检测分析。

核酸适配子筛选过程中所用文库中的单链寡核苷酸两端为固定序列，中间为随机序列。固定序列为引物提供结合部位，便于SELEX筛选过程中进行PCR扩增，富集特异性序列和制备下一轮筛选用的亚文库。随机序列是文库中核酸序列多样性的基础，随机区越长，多样性越丰富。随机区长度一般为30个核苷酸左右，此时文库容量实际上能达到10^14-15（理论上30⁴＝1.15¹⁸），延长随机区可增加文库序列及其分子构象的多样性，但会明显影响PCR扩增时产物的特异性。另外，固定序列的长度则与文库多样性成反比，在总长度一定的情况下，缩短固定序列长度，则可延长随机序列的长度，有利文库有更好的多样性。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如发夹、口袋、假结、凸环、G-四聚体（G-quartet）等，通过分子构象上“锁钥”匹配，加上氢键、范德华力等作用，可与靶分子形成稳定的复合物。10^14-15的巨大库容所拥有的丰富的寡核苷酸分子构象，被认为可为自然界存在的几乎所有分子找到构象匹配的单链寡核苷酸配体（核酸适配子）。

通过SELEX技术筛选靶标的核酸适配子的原理和技术都不复杂，但要成功筛选到理想的核酸适配子却并不简单，其中随机单链寡核苷酸文库序列的设计是关键因素。在SELEX筛选的每一轮中，都要进行一次PCR扩增，以富集能与靶标相对特异结合的单链寡核苷酸序列。一般而言，随机单链寡核苷酸文库在进行PCR扩增时有一个非常独特的现象，就是随着循环次数的增加，各种大小不一的非特异性产物迅速增多，而且目的条带不断减少，从而严重干扰亚文库的制备，甚至导致筛选失败。造成这一特殊现象的原因主要是文库的随机序列的存在，因文库的序列多样性达10^14-15，单链寡核苷酸之间的部分碱基局部性相互配对难以避免，引物与某些寡核苷酸之间的错配也难以消除。要减少寡核苷酸相互配对和引物错配，理论上可以缩短随机序列的长度。然而，从文库中筛选能与靶分子构象适配的单链寡核苷酸（核酸适配子），其前提是文库中的寡核苷酸序列分子构象多样性必须足够，也就是说文库的中间随机序列必须足够长，才有可能形成丰富分子构象。因此，在核酸适配子筛选时的首要问题是设计一个随机序列长度足够的文库，在这个前提下，改善文库的PCR扩增特性，既能有效获得目的产物，又能有效抑制非特异性产物形成，这是成功筛选到理想的核酸适配子的关键。