[发明专利]检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单抗及酶联免疫方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体及一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫方法与试剂盒。

背景技术

孔雀石绿、结晶紫属于三苯甲烷类染料，可用作杀菌、驱虫剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类。由于孔雀石绿和结晶紫具有潜在的致癌性，已被许多国家禁用，但是目前还存在非法使用的现象，因此很有必要加强对于该药的检验监测。

孔雀石绿和结晶紫可分别代谢为无色孔雀石绿及无色结晶紫，目前，对于孔雀绿、结晶紫及其代谢物残留检测的方法主要是高效液相色谱法，该方法虽然灵敏、准确，但样品前处理繁琐、检测时间长、耗资大、技术性要求高，且要有昂贵的仪器，不适合大量样品的高通量检测。酶联免疫检测方法(ELISA)是利用免疫反应(即抗原-抗体结合反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对药物进行定性和定量分析的一种综合性检测技术，它具有操作简便、高通量、高灵敏度、低费用等优点，能克服仪器检测方法的不足之处。

申请号为200810202733.8的中国专利公开了一种检测孔雀石绿的酶联免疫试剂及方法，该发明采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原分别与钥孔槭血蓝蛋白和牛丙种球蛋白偶联得到免疫原和包被原，所得到的酶联免疫试剂及方法仅能检测孔雀石绿，无法检测其代谢产物及结晶紫的代谢产物。申请号为200910058317.X的另一篇中国专利公开了测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是合成氨基无色孔雀石绿作为半抗原，分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白偶联得到免疫原和包被原，通过免疫动物获得多克隆抗体，该发明所采用的半抗原合成方法复杂，涉及到加氢等比较危险的反应体系。

发明内容

本发明的第一个目的是对孔雀石绿半抗原进行结构改造，合成对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿作为半抗原，进而提供出一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用所述该单克隆抗体，建立一种能用于孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫检测的酶联免疫方法。

本发明的第三个目的是提供一种检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫试剂盒。

本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供包含所述单克隆抗体的试剂盒在动物源性食品中孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫检测中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201143的杂交瘤细胞4B10所分泌的。

上述杂交瘤细胞4B10，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201143。

所用的免疫原是由半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿与人血清白蛋白偶联制备的。

进一步，本发明提供了一种用于孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫检测的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿(LMG-HEO)与人血清白蛋白(HSA)偶联得到免疫原(LMG-HEO-HSA)；

(2)将半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿(LMG-HEO)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(LMG-HEO-OVA)；

(3)利用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO：C201143的杂交瘤细胞4B10；

(4)用保藏号为CCTCC NO：C201143的杂交瘤细胞4B10制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体(如酶标板)；

(6)取均质好的组织样品，用乙腈超声提取、离心，取乙腈层用氮气吹干，残渣用含0.05体积％吐温20的10mM PH为7.4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待测物；

(7)取待测物进行ELISA检测。

步骤(6)含0.05体积％吐温20的10mM PH为7.4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法为：准确称取三羟甲基胺基甲烷(Tris)1.211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调pH值至7.4，再加0.5mL吐温20溶解，定容至1000mL。