[发明专利]一种基于分步凝胶化原理的三维细胞组装方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于离散/堆积成形及分步凝胶化原理的三维细胞组装方法，属于组织工程技术领域。

背景技术

由于复杂器官人工制造科学和技术发展的强劲要求，如何将细胞组装成稳定的三维结构日益成为学术界、技术界乃至工程界关注的热点。所谓细胞组装，其物理本质为用某种仿生的细胞外基质材料(ECMs，Extra-Cellular Matrixs)将细胞固定在某一空间要求的点位上。空间的各点、各种细胞及其它生命物质均在ECMs的固结下形成一个空间网络，一种空间微环境，所有细胞在其中进行各种生理代谢活动。这种人工仿生外基质材料与各种功能细胞和生命物质形成的结构物被称为类组织前体或计算机辅助成形的人工组织前体(AnalogyTissue Precursor或Artificial Tissue Precursor，ATP)。细胞在ATP中分裂并随着仿生ECMs的降解而由细胞分泌的ECMs完成复杂三维细胞组装结构的进一步塑型，继续体外或植入体内培养形成具有某种功能的组织或器官(原始器官)。

ECMs固定细胞形成ATP的原理无非是物理交联(通过控制物理条件使含有细胞的人工ECMs凝胶化化)和化学交联(通过控制化学条件使人工ECMs凝胶化化)以及他们的组合。

目前的交联工艺有许多种：

1.Clemson大学的Cell Printing。这是一种深度的物理交联方式，即控制适合的物理参数(温度，湿度等等)，采用完全物理凝胶化而无其它步骤。用类似喷墨打印机喷头将以合适黏度的细胞团簇/水凝胶共混材料低温下喷射堆积成形，待细胞自行粘连后，升温，水凝胶自行解体而去除。

2.EnvisionTec公司的Bio-Plotting。这是一种化学交联与物理交联相结合的方式。将上述含有细胞的共混成形材料直接喷入具有交联作用的化学溶剂中，使之凝胶化。由于随喷随凝胶化，因而凝胶化是伴随成形的实时过程。当然，该技术也可控制交联化学溶剂的温度等物理参数，使物理交联的过程与上述化学交联过程同时进行。

3.“原位交联凝胶化”。即在喷射或挤出含有细胞团簇的ECMs微滴(Droplets)的着陆点(沉积位置)附近，触发相应的凝胶化条件(在空间中充满雾化的触发剂或者喷射触发剂)，材料迅速发生溶胶-凝胶转变，形成具有一定的形态和强度的细胞-材料凝胶。同时，还可以控制成形室的温度，使物理粘连的作用也产生影响，从而达到更佳的固化水平。

纵观各种各具特色的细胞组装方法，可以发现它们的共同特点是采用了一种单步式凝胶化原理(模式)，即用一种物理的或化学的，或物理-化学或化学-物理的方法，使液态的(富含细胞的)物质转变成凝胶态的(保证细胞生存所需的良好生理、化学物理条件)结构。在人们接触此类科学和技术问题初期，由于对此种成形要求认识有限，此种技术路线指导理念是十分自然的。

中国发明专利(申请号：200410009787.4)公开了一种“一种细胞-材料单元的三维受控堆积成形方法”，该方法以“原位交联凝胶化”的技术路线为指导理念，采用离子浓度敏感材料为海藻酸钠，触发离子为Ca离子，整个成形过程及方法只是考虑了堆积过程几何结构成形要求，并没有考虑堆积后ATP在体外培养过程中几何结构的保持能力，而几何结构的保持能力是ATP体外培养或者体内植入的重要特性。这一过程中，膨胀和离子置换是影响培养过程中结构体不稳定的主要因素，而存在于培养过程中这两大因素是不可避免的。

由于对ATP的要求是多方面的，首先是几何结构成形，从形状随意的、液态、胶态等物理状态变成形状，结构和尺寸固定的形态，细胞才有可能完成空间排布的第一步。这种物理状态的转变伴随着复杂结构的成形。它是ATP制造的先决步骤，作为细胞团簇生长的微环境的生理、化学、物理性质如表面形状，弹性，材料降解率，生物相容性以及耐久性等等，则是结构形成后才谈得上的要求。故将诸多的要求分步来实施，以减少技术和工程上的冲突，保证成形质量、降低成本、减少交叉感染、提高成形效率、降低控制的复杂程度，则是更加合理的ATP制造模式。

将凝胶化分成多步完成，比如分为两步：第一步仅以形态、梯度结构、尺寸大小和孔隙率方面即几何要素方面为目标；而成形结构的弹性、强度、耐久性、表面形状、仿生ECMs的降解率、对生物材料和细胞的活性的支持等为第二步凝胶化调控的主要目标。当然，分步的方式与被成形材料和细胞种类有关还含有多种分步方法。

发明内容