[发明专利]一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用

说明书

技术领域

本发明属于临床免疫学诊断领域，特别涉及一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用。

背景技术

建立简便、快速和准确的结核病诊断技术对于结核病的防控十分重要。目前临床最为常用的结核病诊断方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；结核分枝杆菌（MTB）培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床需要；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应（PCR）技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。而MTB感染的血清免疫学诊断以其固有的操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊精密仪器等优势，是最可能满足经济不发达地区和结核病高发区所亟需的结核病诊断技术。

发明内容

为克服现有技术中的上述问题，本发明的一个目的是提供一种结核分枝杆菌重组HtdY蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

它来自结核分枝杆菌H37Rv。

本发明的另一目的在于提供所述重组HtdY蛋白在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。

HtdY蛋白是结核分枝杆菌生长过程中分泌的一种低分子量蛋白。本发明所使用的HtdY蛋白可以是来自采用本领域公知方法对结核分枝杆菌短期培养滤液进行分离纯化得到的全长序列蛋白，也可以从使用方便考虑，使用其中的一段，例如从全长蛋白中切割或者采用重组方法合成，例如在下文中的制备方法以及实施例中描述的重组方法制备得到的HtdY蛋白（得到的蛋白分子量在47.3kDa±0.3%范围内，等电点在5.1-5.2范围内（参见序列表中的SEQ ID NO: 2）

在一实施方式中，所述HtdY蛋白是具有全长度氨基酸序列的蛋白。

在另一实施方式中，所述HtdY蛋白是用基因重组法以结核分枝杆菌DNA为模板扩增出HtdY基因后克隆、表达得到，其氨基酸序列为SEQ ID No: 2, 通过使用pET32a质粒，在HtdY天然蛋白序列前面加了一段Trx·Taq和S·Taq融合标签及 His·Tag纯化标签。

本发明的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌重组HtdY蛋白的制备方法，包括以下步骤：

  （1）结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；

  （2）HtdY基因的扩增；

  （3）HtdY基因插入表达质粒；

  （4）将构建的表达质粒转化入宿主细胞；

（5）诱导表达蛋白HtdY；

（6）分离纯化诱导表达产物，得到HtdY重组蛋白，

其中，在制备结核分枝杆菌HtdY基因中采用的引物为HtdY-F和HtdY-R，所述引物HtdY-F的核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示，所述引物HtdY-R的核苷酸序列如SEQ ID No: 4所示。

本发明的重组结核分枝杆菌HtdY蛋白的制备方法中，提供了一种新的重组质粒，即将HtdY基因序列插入商用表达质粒序列中。HtdY基因NCBI登录号为CP002992.1；蛋白号为： NP_217906.1。

本发明的“HtdY基因序列”也包括对CP002992.1中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与CP002992.1核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。该术语还包括在中度严密条件下，更佳地在高度严密条件下与CP002992.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与CP002992.1的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。

本发明的重组质粒，通常将HtdY基因插入表达质粒的多克隆位点处得到。

本发明的重组质粒在制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作性地连接于表达调控序列，从而形成蛋白表达载体。

本发明中可采用的载体包括且不仅限于pET32a。本发明的一个实施例中，所用的质粒为pET32a。

用作检测试剂的HtdY重组蛋白与NCBI上的NP_217906.1蛋白序列相比，加入了载体相关序列和纯化标签。例如，使用pET32a质粒时，蛋白序列后面加了pET32a上的相关序列和一段His Tag纯化标签。