[发明专利]婴幼儿米粉中核苷酸含量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种婴幼儿米粉中核苷酸含量的检测方法。

背景技术

核苷酸包括胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤核苷酸，分别简称为CMP、AMP、UMP、GMP和IMP，核苷酸可以维持免疫系统的正常功能，提高人体对各类病菌的抵抗力。核苷酸能促进小肠成熟，改善肠道吸收功能。还可以刺激双歧杆菌生长，减少婴儿便秘、腹泻的发生。此外核苷酸还有极好的抗氧化作用，维持肝脏的正常功能。

目前公司新推出的婴幼儿米粉产品中便添加了核苷酸，对于食品中核苷酸的含量测定，国标中尚未有相应的检测方法。因此，开发婴幼儿米粉中核苷酸的含量检测方法对调配出最适于婴幼儿成长所需的含核苷酸米粉有着重要意义。因谷基中含较多淀粉和植物蛋白，样品溶解后呈糊状，容易造成干扰和过滤困难，因此加入高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶进行酶解解决存在问题。为将谷基样品中的核苷酸充分提取出来，本方法采用超声提取，再进行离心净化。最大限度减少损失和干扰，提高了实验的可行性和检测结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种婴幼儿米粉中核苷酸含量的检测方法。旨在以方便、快捷、准确地检测婴幼儿米粉中核苷酸的含量。

本发明，其原理是：将婴幼儿米粉中的淀粉和植物蛋白先用高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶酶解后，利用超声波提取，高速离心净化，经紫外检测器测定，外标法定量。

本发明，包括如下工作步骤：

（1）试剂准备，所用试剂包括：

（a）甲醇：色谱纯；

（b）四丁基硫酸氢铵：色谱纯；

（c）磷酸氢二钾：分析纯；

（d）磷酸二氢钾：色谱纯；

（e）乙酸：优级纯；

（f）木瓜蛋白酶：酶活力≥600U/g，0.2-0.4g；

（g）高峰氏淀粉酶：酶活力≥4000U/g,0.2-0.4g；

（h）核苷酸标准品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和IMP：纯度≥98%；

（i）0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称取13.60g磷酸二氢钾用超纯水溶解并定容至1000mL；

（j）0.1mol/L磷酸氢二钾溶液: 称取2.28g磷酸氢二钾用超纯水溶解并定容至100mL；

（k）100mL/L乙酸溶液：吸取10mL乙酸，加超纯水定容至100mL；

（l）含1.40mmol/L四丁基硫酸氢铵的0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液：取100mL0.1mol/L磷酸二氢钾溶液，加0.4753g四丁基硫酸氢铵，用0.1mol/L磷酸氢二钾溶液调pH至3.3，用超纯水定容到1000mL； 

（m）核苷酸标准混合液：分别准确称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP、GMP、IMP各10-20mg, 混合后用超纯水溶解并定容至100ml，此标准混合液中的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP含量各为100-200μg/mL；

（n）核苷酸标准工作液：分别吸取标准混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5个100ml容量瓶中，加超纯水定容至100mL,配成核苷酸系列标准工作液；

（2）仪器设备，仪器设备包括:

（a）高效液相色谱仪：岛津 LC-20AT泵，SPD-20A紫外检测器； 

（b）电子天平：精确至0.0001g；

（c）超声波提取器；

（d）高速离心机；

（3）样品处理：

（a）酶解：称取样品5g-10g，精确至1mg, 置于100mL-200mL三角瓶中,加入0.2-0.4g高峰氏淀粉酶，0.2-0.4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50℃水，搅拌均匀，置50℃培养箱中培养2-4h；

（b）超声波提取：将酶解后的样品置于超声波振荡器上超声提取10-20min，取出冷却至室温，用100mL/L乙酸溶液调pH至3.3，将试样移入100mL容量瓶，用超纯水定容；

（c）高速离心净化过滤：定容后样液转入50mL离心管于10000r/min的离心机离心5min，上清液经中速滤纸过滤，用一次性注射器吸取滤液1-2mL经0.45μm水系滤膜过滤，滤液即为最终样液，供HPLC测定。保留时间定性，外标法定量；

（4）色谱条件，色谱条件包括：

（a）色谱柱：CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6mm,5μm）或相当者；

（b）进样量：10μL；

（c）流速：1.0mL/min；