[发明专利]肠道病毒71型cDNA感染性克隆、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及RNA病毒拯救技术，具体地说，涉及肠道病毒71型cDNA感染性克隆、其构建方法及应用。 

背景技术

肠道病毒(Enterovirus)71型(EV71)属于小核糖核酸病毒科，肠道病毒属。基因组为单股正链RNA。EV71主要感染5岁以下的儿童，通过粪-口途径或飞沫进行传播，其感染主要引起手足口病(HFMD)，在临床上与柯萨奇病毒A16感染所引起的手足口病难以区别。严重的EV71感染还能引起无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹以及心肌炎和肺水肿等多种与神经系统相关的疾病，导致重症甚至死亡病例的发生。EV71自1969年首次由Schmidt等从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来后，已在世界范围内引起十多次的爆发和流行。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势，令人关注的是该地区的EV71感染引起越来越严重的中枢神经系统症状。2008年和2009年以EV71感染为主的手足口病在中国大陆多个省市流行，共导致479名儿童死亡。目前尚无治疗EV71感染的特效药物，主要通过对症治疗控制病情的发展。 

应用反向遗传学技术构建RNA病毒的感染性克隆，比传统的细胞传代方法制备病毒的安全性高，并且可以避免病毒在传代过程中引入的突变。此外通过基因工程的技术手段可以容易地实现对病毒基因组的改造，如定点突变、重组、缺失和嵌合等，为阐明病毒的致病机制，研发新的抗病毒药物及获得新的疫苗候选株奠定重要的基础。 

Racaniello VR和Baltimore D于1981年首次利用反向遗传学技术构建了脊髓灰质炎病毒的cDNA感染性克隆，提供了在DNA水平上研 究RNA病毒的可能。2005年，Arita等构建了EV71标准株BrCr的一系列变异体的感染性克隆，研究了在猴子模型中，决定温度敏感性的突变位点对病毒神经毒力的影响。近年来，中国大陆时有EV71的流行爆发，迫切需要构建出能够代表我国EV71流行株特点的感染性克隆，为研究EV71的致病机理和抗病毒药物提供技术支持。缺乏我国EV71流行株的感染性克隆以及EV71的快速变异，使得利用传代病毒进行药效评价的结果可靠性差，成为影响抗EV71药物研发的主要技术瓶颈。因此构建我国EV71流行株的感染性克隆，将填补我国EV71标准株的空白，并为抗EV71病毒药物的研发及EV71疫苗的研发奠定重要基础。 

发明内容

本发明的目的是提供肠道病毒71型流行株的cDNA感染性克隆、其构建方法及应用。 

为了实现本发明目的，本发明的一种肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其是通过反向遗传操作技术获得的肠道病毒71型SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。所述肠道病毒71型SZ98 pro株是中国深圳98的实验室传代株(SZ98 pro)。 

前述的肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第215位Pro替换为His，或将第362位Glu替换为Gly，均不会影响其功能。 

前述的肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。 

本发明还提供一种构建上述肠道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以肠道病毒71型SZ98 pro株的基因组为模板，通过RT-PCR得到全长cDNA克隆。 

本发明还提供含有上述肠道病毒71型cDNA感染性克隆的载体。 优选地，出发载体为pBR322。 

本发明还提供含有上述载体的宿主细胞，其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SZ98 pro/pBR322/DH5α，已于2011年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5659。