[发明专利]一种以大豆吉林35号胚尖为外植体的高效遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及以大豆胚尖为外植体，筛选高再生率且对农杆菌高度敏感的基因型，配合高效的侵染方式，提高了农杆菌的转化效率。

背景技术

大豆是重要的油料作物和饲料作物，利用转基因技术提高大豆品质是当今育种的重要方向，虽然转基因大豆已经在全球大规模种植，但其遗传转化仍是难点之一，因此，建立一个高效、稳定的再生体系是解决大豆遗传转化率低的基石。大豆组织培养的研究可追溯到20世纪60年代，直到80年代才取得飞跃性突破，通过大豆的原生质体、下胚轴、小真叶、幼胚、子叶节、胚尖等外植体相继获得了再生植株。

目前，已经建立的大豆遗传转化体系仍存在组培操作技巧性强、植株再生率低、重复性差等问题，严重制约了利用分子生物学手段改良遗传性状。所以，建立一个简便、高效、稳定的再生体系是大豆遗传转化成功的基础，也是众多研究者需要解决的关键性问题。

近些年发展起来的大豆胚尖再生体系因取材方便、再生周期短、操作简便、褐化率低等优点，已经广泛应用于大豆遗传转化技术中。但胚尖再生体系同样存在一些致命的缺点，如基因型依赖性强、转化率低等。

因此，筛选适合胚尖再生体系的基因型，采取高效的侵染方式，并建立专属于这个基因型的遗传转化体系，提高转化效率，对大豆遗传转化的发展具有重大实践意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以大豆吉林35号胚尖为外植体的高效遗传转化方法。

本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：

（1）选取种皮完整无病害的吉林35号大豆种子，自来水冲洗干净后用75%的酒精处理50s，无菌水冲洗3～5遍，而后浸泡于无菌水中6h并切取外植体胚尖；

（2）将外植体先进行超声波处理6s，之后用真空泵辅助农杆菌侵染15min，并于侵染液中添加0.03% Silwet L-77；

（3）侵染后的胚尖外植体转接到共培养基中，共培养基附加3.0 mg﹒L^-1 6-BA以诱导丛生芽和3.0 mg﹒L^-1 硝酸银以抑制褐化和坏死；

（4）共培养3天后移接至丛生芽伸长培养基中，伸长培养基附加0.5 mg﹒L^-1 6-BA与0.2 mg﹒L^-1 IBA，此阶段添加筛选剂Basta 0.6 mg﹒L^-1；

（5）待再生植株长到4.7~5.3cm时，接入生根培养基，生根培养基以蔗糖作为碳源，选用1/2 MSB并附加0.5 mg﹒L^-1 IBA，待根长势健壮后移栽至营养钵中；

（6）移栽后提取叶片DNA做PCR检测，并采用bar基因试纸条进行蛋白检测。 

本发明所使用的大豆品种，由吉林大学植物种质资源与利用研究室提供。

此项发明以大豆胚尖为外植体，首先，对十个基因型:吉林35、吉林47、平安8、东农42、美国扁茎、吉大豆1号、吉大豆2号、吉大113、合丰43和绥农10和5个6-BA,0、0.2、0.5、1.0、3.0和 5.0 mg﹒L^-1水平的诱芽率进行了双因素试验，然后对十个品种进行GUS基因的瞬时表达，测定荧光值，综合上述两个试验结果，筛选出高再生率且对农杆菌敏感的品种吉林35。继而，以吉林35号胚尖为受体材料，进行氯气、升汞和酒精三种种子消毒方法比较，消毒后浸泡于无菌水中6h，切取外植体胚尖直接进行农杆菌侵染，采用静止、摇床、真空泵三种侵染方式，10min、15min、20min三个侵染时间与超声波处理组合，并于重悬液中添加0.03% 和0.06% Silwet L-77。共培养期间采用3.0 mg﹒L^-1 6-BA诱导丛生芽，并于培养基加入不同浓度脯氨酸和硝酸银（0、1.0、2.0、3.0、4.0和 5.0 mg﹒L^-1），以抑制褐化，诱芽阶段不添加任何激素和附加物质，丛生芽伸长培养基设置3种6-BA浓度（0.0、0.2和0.5 mg﹒L^-1）和3种IBA浓度（0.0、0.2和0.5 mg﹒L^-1），生根培养基中设置1/2 MSB、1/4 MSB、蔗糖、葡萄糖和3种IBA浓度（0.2、0.5和1.0mg﹒L^-1）共12种组合。以合丰35、东农42为对照，采用常规遗传转化方法，而吉林35采用上述的遗传转化方法，移栽后提取叶片DNA做PCR检测，并采用bar基因试纸条进行蛋白检测，最后比较三者间转化率。