[发明专利]一种猪细环病毒Ⅱ型抗体间接阻断ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪的一种病毒抗体检测方法，具体说是猪细环病毒II型(TTV2)抗体的间接ELISA检测方法。 

背景技术

养猪业是我国畜牧养殖业的重要组成部分，在我国的农业经济中占有着非常重要的地位，然而猪病的肆虐不但制约着我国养殖业向规模化、集约化方向的迈进，而且影响着我国畜牧类产品的进出口等国际化多边贸易的发展，同时会给国家和地区带来巨大的社会、经济和人类生命财产损失。猪细环病毒常与猪圆环病毒、蓝耳病毒发生混合感染，给猪的生产带来了严重的影响和危害。猪细环病毒的防控直接影响着我国养猪业的发展，是我国畜牧业生产所关注的重点。 

1997年12月，日本学者Nishizawa等利用代表性差异分析法(represenatational difference analysis)，首次从一位名为Torque Tero的输血后非甲-非庚型肝炎病人的血清中克隆获得了一种新的不明病原DNA(N22)，克隆的病毒DNA序列并不与任何一条参考序列相同或相近，因此证明此病毒可能是一个新的病毒。近十五年来，学术界对TTV的研究取得了一定的进展，对该病毒有了较深的认识。2005年国际病毒分类命名委员会将该病毒分类为圆环病毒科指环病毒属，并统一命名为Torque Tero病毒，而不称其为输血传播病毒(transfusion trarismitted virus TTV)，我国学者也将其翻译为细环病毒。该病毒为一种小的十二面体的无囊膜的单股环状负链DNA病毒，能感染多种脊椎动物，包括人和猪。根据基因序列差异，将猪的TTV分为两种不同的基因型，即基因I型和基因II型(TTV1和和TTV2)。 

2002年，日本学者Okamoto首次从猪体内检测到了种属特异的猪TTV病毒的存在，与人TTV属于同一类，此后世界各地陆续报道该病毒的发现。目前已经证明TTVs与PRRSV、PCV等混合感染会加重猪皮炎和肾病综合症(PDNS)和断奶和多系统衰竭综合征(PMWS)的症状。 

TTV在猪群中的感染呈全球性分布，包括美国、加拿大、中国、台湾、韩国、法国、 意大利和西班牙等国都有不同程度的感染，其感染率在24％～100％。通常在同一猪群中TTV2的感染率较TTV1高，母猪较公猪易感。同一国家不同地区或不同猪场中TTV感染存在很大的差异。对意大利不同猪场的调查发现，一些猪场不存在TTV1的感染，然而另外一些猪场的感染率却高达53％。对我国广东、福建、江西、河北、安徽、浙江和河南7省258份猪血样品的TTV检测结果表明：TTV感染率在24.1％～100％之间。此病毒感染一旦发生，就很难控制和消灭，因此及时准确的检测TTV，预防和控制该病毒的感染，对于畜牧业特别是养猪业具有重大的意义。 

目前猪TTV的检测主要依赖PCR技术，但也有人应用双抗原夹心酶联免疫法(ELISA)。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪细环病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒及猪细环病毒II型ORF1基因优势抗原表位区所表达蛋白(在本发明申请中以下简称ORF1蛋白)作为抗原(在本发明申请中以下简称为重组抗原)包被酶标反应板的制备方法，为临床检测猪细环病毒抗体提供快速、准确、简便的检测工具。 

本发明技术方案： 

一种猪细环病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒，包括抗体检测板，酶结合物工作液，样品稀释液，显色液A，显色液B，终止液；阻断抗体，洗涤缓冲液；所述的阻断抗体为使用纯化后的TTV2-ORF1基因抗原表位区蛋白免疫家兔后，从家兔体内获得的多克隆抗体； 

所述酶结合物工作液为：商品化的辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体，进行1∶12000稀释的稀释液，酶标二抗直接加入酶标二抗稀释液中，酶标二抗稀释液为：KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 29g，KCl 0.2g，PEG6000 40g，加ddH₂O定容至1000ml，加入0.01％～0.05％硫柳汞，调pH至7.4； 

所述样品稀释液为：KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 29g，KCl 0.2g，PEG600040g，加ddH₂O定容至1000ml，加入0.01％～0.05％叠氮钠，调pH至7.4；