[发明专利]农杆菌介导梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及以通过农杆菌介导、利用梅花成熟子叶再生体系进行遗传转化方法。

背景技术

梅花(Prunus mume)属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物，是中国十大传统名花之一，国外仅日本、朝鲜、新西兰等少数几个国家有种植。根据植物采集家的实际工作和中、日若干古籍的记载，肯定了中国乃梅之故乡。梅花主要分布于我国的长江流域及整个江南地区。川、滇、藏交界的横断山区和云贵高原一带被认为是梅、半野生梅的自然分布中心，即梅的变异与种质多样化中心。在我国有7000年以上的应用史和2000年以上的栽培史。梅花集色、香、姿、韵于一身，有“梅天下尤物”的美称，具有极高的观赏价值。其生性较为耐寒(一般能耐-5℃的低温)，且开花较早，能在早春怒放。

然而，梅花一般不能抵御-15℃--20℃的低温，仅杏梅系的品种除外。梅花绝大多数品种(多属真梅系)集中分布于我国长江流域一带，在北方梅花品种则较少且主要以杏梅系和樱李梅系为主，少见真梅系品种，有“南梅北杏”之称。此外，梅花切花品种较少。为了使梅花在我国分布范围更为广泛，为了使梅花的栽培应用国际化，培育出大量的抗寒品种势在必行。

传统的梅花品种选育和品质改良多采用实生苗选种、杂交育种等，这些方法周期长、偶然性大、消耗大量人力物力，且受季节限制，同时在性质改良上局限性很大。而现代化的生物技术，特别是植物基因工程的应用则可以克服传统育种方法的局限性，可以使我们在较短的育种周期内获得大量符合我们要求的植株。植物基因工程技术在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，能够利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，从而为培育梅花新品种提供了新的途径。

要获得转基因植物，最重要的前提是要建立遗传转化体系所需的植株再生体系。目前梅花再生体系的建立还存在较大的难度，目前只有从樱李梅系的‘美人’梅叶片再生出不定芽，并获得完整植株，所以有关梅花遗传转化成功的报道非常有限。目前只有一篇关于梅花遗传转化的报道，Mei Gao et al.(2010)以梅花品种‘Nanko’的未成熟子叶作为遗传转化受体，利用体细胞胚发生途径，经农杆菌侵染、共培养、选择培养、萌发培养、增殖培养和生根培养，转化GUS报告基因并得到抗性植株。这篇报道采用梅花未成熟子叶作为转化受体材料，通过体细胞胚发生途径，建立了一个遗传转化体系并且得到了抗性植株，但是转化效率极低，而且体细胞胚的诱导对于未成熟子叶的大小有严格的要求，当未成熟子叶为2-3mm长的时候，诱导效率最高，小于或者大于2-3mm的时候诱导效率均很低，这对于外植体的采样时间有严格要求，一年只能够采样一次，而且未成熟的果实容易腐烂不易保存，不能周年进行细胞培养和生产；并且在遗传转化的过程中，未成熟子叶经侵染和共培养后延迟筛选7d，这势必导致假阳性率高，转化效率低，这些都不利于转化。目前，国内外还没有关于以梅花成熟子叶为受体进行遗传转化的成功报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种以梅花成熟子叶再生体系为基础，通过农杆菌介导的方法，建立一种梅花遗传转化体系，该体系不需要通过胚发生途径，直接获得转基因植株。

本发明的技术方案如下：

一种农杆菌介导的梅花成熟子叶直接再生体系的遗传转化方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，以梅花成熟子叶作为遗传转化的受体材料，不经过体细胞胚发生途径，通过直接的器官发生途径获得转化植株，其步骤经预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、成苗培养和生根培养，将GUS报告基因和正义PmCBFb基因导入受体细胞，利用抗生素进行抗性筛选，通过GUS化学染色或PCR检测筛选得到转基因植株，其步骤如下所示：

1)预培养：将消毒后梅花成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2℃，光照强度为20001x光下预培养0-5d；