[发明专利]农杆菌介导梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的梅花成熟子叶直接再生体系的遗传转化方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，以梅花成熟子叶作为遗传转化的受体材料，不经过体细胞胚发生途径，通过直接的器官发生途径获得转化植株，其步骤经预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、成苗培养和生根培养，将GUS报告基因和正义PmCBFb基因导入受体细胞，利用抗生素进行抗性筛选，通过GUS化学染色或PCR检测筛选得到转基因植株，其步骤如下所示：

1)预培养：将消毒后梅花成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2℃，光照强度为20001x光下预培养0-5d；

2)菌株的制备：从-70℃冰箱中取出保存的包含有GUS报告基因和正义PmCBFb基因的农杆菌EHA105，用接种环在100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28℃温箱中黑暗培养直至单菌落产生；挑取单菌落接种于100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28℃恒温摇床上200r/min振荡培养过夜；然后将对数生长期为OD₆₀₀＝0.6-0.8的菌液从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心10min，去上清液，将收集得到的农杆菌置于100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基中，作为重悬液使用，在28℃恒温摇床上200r/min重悬培养2-4h后用于转化受体的侵染；

3)侵染：将步骤1)的梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入步骤2)中制备好的农杆菌菌液侵染10-30min，期间每隔2-3分钟摇动一下；

4)共培养：将步骤3)中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2℃，黑暗条件下培养1-5d；

5)选择培养：将步骤4)中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2℃光下培养，光照强度为20001x，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化；

6)成苗培养：将步骤5)中再生出的不定芽接种到到成苗培养基培养，对获得的抗性芽进一步的筛选和促进生长，于光下培养，光照强度为20001x，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗；

7)生根培养：将步骤6)获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001x，直到获得抗性植株；

8)将步骤7)中获得的转GUS报告基因的抗性苗进行GUS化学染色，验证获得转基因植株；或

提取步骤7)中获得的转正义PmCBFb基因植株的基因组DNA，进行PCR检测，验证获得转基因植株；

培养基组分及配制：

成熟子叶再生培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

共培养培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，乙酰丁香酮100μmol/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

选择培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，卡那霉素20mg/L，头孢霉素300mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

成苗培养基：1/2MS，玉米素1.0mg/L，3-吲哚乙酸0.1mg/L，卡那霉素20mg/L，头孢霉素300mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

生根培养基：1/2MS，α-萘乙酸0.5mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0。

1/2MS液体培养基：1/2MS+100μmol/L AS+蔗糖30.0g/L，用蒸馏水定容至1L，pH5.5。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的成熟子叶预培养时间为3d。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的农杆菌的侵染时间为20min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的农杆菌与转化受体的共培养时间为3d。