[发明专利]以适体为识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种非标记可视化检测方法，特别涉及一种以适体为识别单元的胶体晶体凝胶薄膜为载体的非标记可视化检测方法。

背景技术

生物传感器是简单、快速、廉价的重要检测工具。在生物传感器的分子识别元件中，目前应用最为成熟的就是抗体。但抗体由于制备繁琐、成本高、耗时长、保存条件苛刻、固定化易失活等缺点使其应用受到限制。探索新型高特异高稳定的分子识别物质，建立高选择性高灵敏的生物传感技术成为现代分析化学研究的前沿课题之一。随着人类基因组计划的完成及核酸研究的发展，特别是1990年美国科学家Tuerk和Ellington筛选出首个核酸适体，随后核酸适体及SELEX技术的快速发展，抗体技术受到了前所未有的挑战。利用体外筛选技术获得的适体，由于其独特的优点，成为新一代理想的传感器识别元件，适体传感器的研究受到了科学家们的极大关注。

与目前在生物医学领域中广泛应用的抗体相比，核酸适体是一种全新的分子识别方法，核酸适体不仅能和抗体一样与目标分子高效专一结合，还具有许多抗体无法比拟的优点：筛选周期短，成本低、靶分子种类广泛、高特异性和高亲和力、修饰灵活、稳定性好等。正是由于以上种种优势，适体已成为一种极富应用潜力的识别分子识别探针，可应用于各种小分子、蛋白质、及细胞检测系统的构建，为生物传感器的研究提供了一个崭新的平台。

胶体晶体是由一种或多种单分散的胶体颗粒(无机或有机，尺度在微米或亚微米级)组装形成的具有二维或三维有序结构的一类物质，其最基本的特征是光子带隙。胶体晶体衍射波峰位置遵循布拉格衍射公式，即mλ＝2ndsinθ，其中m为衍射级数，λ为衍射波长，n为胶体晶体的平均折射率，d为胶体晶体的晶格间距，θ为入射光角度。由此可见，衍射光的中心波长(即特征反射峰)与平均折射率和晶格常数有关。响应性胶体晶体是指光子带隙对外界环境的变化具有响应性的胶体晶体。自1997年Asher等开发了新型的胶体晶体化学智能传感材料以来，响应不同外界环境的胶体晶体逐渐成为胶体晶体研究领域的一大热点。胶体晶体传感器主要是利用胶体晶体能够产生布拉格衍射的性质，通过外界环境的激励改变其平均折射率或晶格常数，从而会引起衍射峰的改变。在某些情况下胶体晶体受外界刺激的响应而引起的特征反射峰的变化，可以被人的裸眼直接观察到，因此胶体晶体作为一种新的可视化传感材料在生物、化学传感等方面已崭露头角。通过胶体晶体结构的设计，目前已经有许多基于胶体晶体的传感器被制备出来。

但是目前已开发的胶体晶体传感器还存在的传感器功能简单，分子识别单元抗体易失活，检测方法单一等缺点，严重制约了胶体晶体传感器的灵敏度、选择性、重复使用性和快速响应能力等性能指标。

发明内容

为了解决现有非标记可视化检测选择性差，成本高等缺点，本发明提供一种以适体为分子识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种以适体为识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)胶体晶体水凝胶薄膜的制备：将单分散的胶体纳米粒子加入水凝胶前聚体溶液中，调节胶体纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为10％～80％，超声分散，直至胶体纳米粒子溶液产生结构色；然后加入引发剂后，灌入模具，静置0.1～2h，经紫外光照射聚合或烘箱内通过热固化法对结构色胶体溶液进行固化，即得胶体晶体水凝胶薄膜，将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于纯水中保存；

(2)适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜的制备：

通过化学键偶联方法将适体偶联在步骤(1)中洗涤后的胶体晶体水凝胶薄膜上，制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用磷酸缓冲液洗涤之后得到检测用的胶体晶体水凝胶薄膜，测定检测用的胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱；

(3)目标分析物的检测：

将步骤(2)中得到的检测用的胶体晶体水凝胶薄膜在缓冲溶液中与待测样品混合进行适体和样品的特异性结合反应，反应完毕，洗涤后检测反应后的胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，通过比较反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定待测物质的含量。

优选的，所述方法步骤(2)采用的适体为分子识别单元，为核酸适体或RNA适体中的一种或多种。