[发明专利]一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统

说明书

技术领域

本发明细胞培养技术领域，特别涉及一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，适用于人多能干细胞的长时间培养。

背景技术

人多能干细胞典型特点是，在体外不断自我更新，同时保持向各个胚层细胞分化的潜能。由于人胚胎干细胞建立涉及伦理与法律等问题，其研究与应用受到一定的限制。而诱导多能干细胞很好地解决了人胚胎干细胞存在的伦理争议，同时由于其具有与人胚胎干细胞相似的特性，即自我更新与分化潜能，因而为再生医学尤其是个性化的治疗带来了希望。

人多能干细胞不仅为基础研究提供了独特的模型，而且在细胞移植治疗方面具有巨大的应用价值。然而在培养人多能干细胞时，其与动物源制品(如动物血清或动物蛋白)的接触会提高这种细胞吸收非人源代谢产物或被非人源病原污染的风险。例如，在有动物源成分存在的培养体系中，细胞会吸收并表达唾液酸Neu5Gc。由于人类循环系统中存在识别Neu5Gc的抗体，当含有Neu5Gc的细胞或组织移植入人体时，机体会识别这些非人源的抗原，从而对移植细胞或组织产生排斥反应，造成移植失败。同时饲养层的存在导致耗费大量的人力和物力，且饲养层细胞的批次性也会导致系统的不稳定性。因此，确定培养系统中的各种成分则有利于优化培养系统并具有较高的可重复性。

近年，研究者们研究发展出如下不同的人多能干细胞的培养系统：

(一)饲养层培养体系的发展

人多能干细胞最初在以小鼠的胚胎干细胞的培养系统衍化而来的条件下建立并进行培养的，即含有鼠胚胎成纤维细胞的饲养层以及含有胎牛血清的培养基。为降低培养系统中非人源成分，研究者尝试不同组织来源的人源细胞作为饲养层培养人多能干细胞。Richard(Richards，M.，Fong，C.Y.，Chan，W.K.，Wong，P.C.&Bongso，A.、Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2002、20、9、933-6。)等首次以胎儿/成人成纤维细胞作为饲养层，以人血清作为培养基，建立首个无动物源的培养系统。随后人骨髓来源间充质细胞，新生儿包皮细胞，人胚胎干细胞分化来源的成纤维样细胞，胎盘来源的间充质干细胞等被尝试用作人多能干细胞的饲养层。虽然各种人源细胞用于培养人多能干细胞，但是其支持人多能干细胞不分化的能力各不相同。这可能与细胞来源，培养条件的不同等因素有关。同时，制备饲养层的细胞也需要大量的人力、物力，其批次之间的差异性也无法解决。因此，发展无饲养层的培养系统具有更大的应用价值。

(二)无饲养层培养体系的发展

Xu(Xu，C.，et al.、Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971-4。)等首次报道将人多能干细胞培养在由Matrigel(BD公司)作为细胞外基质以及鼠胚胎成纤维细胞来源的条件培养基构成的无饲养层的培养系统内。两种培养系统内人胚胎干细胞的mRNA表达谱相似，说明在此无饲养层的培养系统内，细胞不会受到额外的刺激。Matrigel是鼠EHS瘤细胞的提取物，因其来源提高人多能干细胞临床应用的风险以及其成分的不确定性，因此研究者们尝试以纯化的蛋白或人工合成物替代Matrigel。在胚胎成纤维细胞来源的条件培养基作为培养基以及含牛血白蛋白的无血清培养基中，层黏连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和重组表达的玻璃粘连蛋白(Vitronectin)均被报道能够代替Matrigel长期维持人多能干细胞的增殖。2006年，Ludwig(Ludwig，T.E.，et al.、Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions、Nat Biotechnol、2006、24、2、185-7。)等报道在成分明确的培养基TeSR中使用四种大分子的混合物包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白和胶原IV(Colagen IV)等成功培养人多能干细胞并在此培养系统中建立新的人多能干细胞细胞株。但由于此培养系统的高昂费用不便于推广应用。

(三)培养基的发展