[发明专利]一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统

权利要求书

1.一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，其特征在于：包括支持人多能干细胞长期培养的人源化基质和人源化培养基，所述的人源化基质富含人IV型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白，所述的人源化培养基富含纤维粘连蛋白和玻璃连接蛋白。

2.根据权利要求1所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于：所述的人源化基质按如下步骤制备而成：

(1)新鲜胎盘去掉羊膜与脐带后，剪成不超过0.3×0.3×0.3cm大小的组织块，以冷水将组织块悬起，4℃搅拌，12h后，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织仍用冷水悬起，以冷水洗2天，每12h换水一次，第三次过滤后，将截留的组织用冷的1M NaCl缓冲液悬起，4℃搅拌；其中所述的NaCl缓冲液按如下方法配制：58.5g NaCl与25ml Tris缓冲液，溶于Milli-Q水中，调节pH至7.5，定容至1L；所述的Tris缓冲液按如下方法配制：242.28g Tris碱溶于800ml Milli-Q水中，调节pH至7.5，加Milli-Q水定容至1L；

(2)以冷的1M NaCl缓冲液洗4天，每12h换液一次，第八次更换NaCl缓冲液时，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织用冷的0.5M醋酸溶液悬起，4℃搅拌；

(3)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h换液一次，第六次换0.5M醋酸溶液时，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织称重；以胃蛋白酶∶组织为1∶400的质量比加入胃蛋白酶，同时以200g/L将酶与组织块悬起于0.5M醋酸溶液中，4℃搅拌24h；

(4)7100g，4℃离心1h，去掉上清，收集沉淀并称重，以质量体积比为1∶1的条件加入2M尿素缓冲液，4℃搅拌24h；其中所述的尿素缓冲液按如下方法配制：240.0g尿素、12.1g Tris碱、18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水定容至2L；

(5)13000rpm，4℃离心30min，上清液装入25KD的透析袋中，以TBS缓冲液+0.5％氯仿为周围溶液于4℃透析2h，然后彻底清洗烧杯与透析袋外表面后，以冷的TBS缓冲液为周围溶液，继续4℃透析，每2h换TBS缓冲液一次，共换3次，最后一次透析时，4℃，过夜，透析好的液体，即为人源化基质；其中所述的TBS缓冲液按如下方法配制：12.1g Tris碱，18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水补齐至2L。

3.根据权利要求1所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于：所述的人源化培养基含有人血浆的NaCl沉淀组分。

4.根据权利要求3所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于：所述的人血浆的NaCl沉淀组分按如下步骤制备而成：

(1)将经过安全检测的四种血型的血浆，以等体积比例混合，分装成36ml/BD管，每管加入6ml的林格液，混合均匀后再加入2M CaCl₂至终浓度为20mM，混匀，置于37℃水浴锅孵育两小时，将已凝固的血浆，存于-20℃过夜；

(2)将处理过的血浆从-20℃冰箱拿出置于4℃冰箱，过夜解冻，高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，即是血浆来源的血清；

(3)在4℃冷柜中，向血清中缓慢、均匀地加入NaCl，至终浓度为28g/100ml，搅拌过夜；

(4)高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，将收集的上清用滤纸过滤掉悬浮的小颗粒；

(5)将过滤的上清，装入25KD的透析袋中，在冷的双蒸水中搅拌透析2小时以上；

(6)重复步骤(5)两次；

(7)将步骤6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培养基，搅拌透析过夜；

(8)取出透析袋内的溶液，以外部DMEM/F12培养基为对照，280nm测定蛋白浓度，0.22μm过滤后，保存于4℃，此即为血浆的NaCl沉淀组分。

5.根据权利要求4所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于：步骤(1)中所述的林格液按如下方法配制：将NaCl 0.9g，KCl 0.042g，CaCl2 0.0242g，溶于100ml的双蒸水，用0.22um的滤膜过滤备用。