[发明专利]生物固相酶催化合成L-茶氨酸的生产工艺

权利要求书

1.一种生物固相酶催化合成L-茶氨酸的生产工艺，包括如下步骤和工艺条件：

（1）生物合成：将底物与固相酶催化合成生成L-茶氨酸溶液，再通过离心与生物固相酶分离，所述底物为谷氨酸钠、六水氯化镁、六偏磷酸钠、盐酸乙胺及三磷酸腺苷，底物摩尔浓度比例为谷氨酸钠10～100mmorl，六水氯化镁10～100mmorl，六偏磷酸钠10～100mmorl，盐酸乙胺10～100mmorl及三磷酸腺苷10～100mmorl，底物与固相酶的配比为1morl谷氨酸钠配100～1000KU生物效价单位的固相酶；

（2）分离纯化：生成的L-茶氨酸溶液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的阴离子，再分步洗脱除去阳离子，最后稀氨水洗脱置换游离出L-茶氨酸；

（3）脱色浓缩：茶氨酸水溶液活性炭脱色后，赶氨，真空薄膜浓缩得纯L-茶氨酸浓溶液；

（4）结晶干燥：向L-茶氨酸浓溶液加入95%酒精，于0～40℃搅拌，析出L-茶氨酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得白色L-茶氨酸粉末。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的合成的底物溶液pH值6.5～10。

3.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的生物合成反应温度25～55℃。

4.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的L-茶氨酸浓溶液与95%酒精的体积比为1:5～10。

5.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述固相酶由如下工艺制备：

（A）茶氨酸合成酶的基因克隆及表达：

根据专性亲甲基醇菌 Methylovorus mays No. 9 (Biosci. Biotechnol. Biochem. 72 (1), 101-109, 2008)的茶氨酸合成酶的基因序列，设计一对引物：5’-GAAGGAGATCATATGAAGTCACTG-3’和5’-CTAGGATCCTTAGTAAAACTGTACGTAG CGATTGATTTCC -3’，两对引物各含有内切酶NdeI和BamHI序列，根据Bio-Rad公司iProof多聚酶的说明书扩增基因，其中DNA模板为专性亲甲基醇菌 Methylovorus mays No. 9的基因组DNA，用内切酶NdeI和BamHI消化扩增片段，然后连接到载体pREST-lac 上，得到茶氨酸合成酶表达型质粒pREST-lac-GS；

该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种中表达，将转化的菌落转移到50毫升LB培养液，成份为：16克胰蛋白胨，10克酵母粉，5克氯化钠，37摄氏度振荡培养16小时，离心收集细胞，大生产时，将发酵体积扩大至吨级规模，管式离心机连续离心收集菌体；

（B）酶的纯化与固定化：

取菌体细胞以4倍体积的磷酸缓冲液（20mM, pH7.4）悬浮，800bar高压破碎，加5M磷酸盐溶液（pH8.0）至终浓度为1.2M，缓慢搅拌下加适量1%聚丙烯酰胺及氯化钙溶液使结絮，板框过滤或高速离心去渣，清液为酶粗提物溶液，测定蛋白含量；

以每15mg蛋白/克载体的量向酶溶液加入环氧型固相酶载体，室温缓慢搅拌24小时，弃上清，所得固相酶分别以20mM磷酸盐缓冲液（pH7.4）、含1M 氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液（pH7.4）及20mM磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤，最后，测定固相酶的活性。