[发明专利]一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明属于医学免疫学领域，涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法检测试剂的制备方法，特别是涉及一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球与蛋白质的共价偶联的方法。

背景技术

胶乳增强免疫比浊法由于具有检测方法简单方便，线性范围宽，稳定性好，同时可在全自动生化仪上实现大量样品检测等优点，已经越来越多的被应用于临床检测项目。胶乳增强免疫比浊法是通过采用物理吸附或共价键合的方式将抗体或抗原偶联到纳米微球的表面，形成微球-抗体(抗原)复合物。此复合物与样品中的抗原(抗体)，通过抗体抗原反应，形成微球-抗体-抗原聚集颗粒，随着免疫反应的不断发生，聚集的颗粒不断增大，从而导致溶液在一定波长(如600nm)的吸光值发生显著的变化，通过测定免疫反应前后吸光度值的变化可以计算出样品中抗原(抗体)的浓度，从而达到检测和诊断疾病的目的。迄今，胶乳增强免疫比浊分析方法在临床中已经应用于检测脂蛋白a、抗链球菌溶血素“O”、类风湿因子、C-反应蛋白、β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、D-二聚体、胱抑素C、肌钙蛋白、肌红蛋白、CK-MB、甲胎蛋白、糖化血红蛋白和前列腺特异性抗原等多种检测项目，诊断领域已涉及肿瘤、风湿、肝功能、肾功能等多个领域，拥有广阔的应用前景。

胶乳增强免疫比浊法一般采用双试剂，即反应试剂(R1)和反应试剂(R2)，其中，R1为带有一定浓度促凝剂的缓冲溶液，R2为固定化抗体(或抗原)的胶乳微球溶液。R2是胶乳增强免疫比浊法的核心部分，对胶乳增强免疫比浊试剂的检测灵敏度、线性范围以及稳定性起决定作用。而在胶乳试剂R2的制备过程中，选择的胶乳微球以及在微球上固定化抗体(或抗原)的工艺决定了制备的胶乳试剂R2的性能。抗体(或抗原)在本质上都是蛋白质，将蛋白质偶联到胶乳微球上主要有两种方式，即物理吸附与化学偶联。物理吸附的蛋白质在长期储存过程中易从胶乳微球表面脱落，进而使检测灵敏度下降；化学偶联的蛋白质可被稳定固定在胶乳颗粒表面，目前的常规偶联方法是碳二亚胺法，但是此方法在偶联过程中易使胶乳微球聚集，不利于后续胶乳微球的处理。此外，在抗体与微球偶联后，需将残余抗体与偶联了抗体的胶乳微球分离，离心是现有报道的工艺中最常用的分离方法(专利，申请号：201010192601.9)。但是离心分离残余抗体的方法容易导致偶联抗体的胶乳微球的聚集，需要采用超声等分散方法将偶联抗体的胶乳微球重新悬浮分散。而在分散过程中容易导致抗体失活和从胶乳微球上的脱落，并且离心的方法不利于胶乳比浊试剂的放大生产。此外，由于抗体的活性端为Fab片段，在偶联过程中也可与胶乳微球发生反应，从而无法用于与抗原发生免疫反应，因此使抗体的活性端尽量暴露，提高抗体的利用率，将对降低生产成本具有重要意义。但是目前常用的胶乳微球和偶联工艺均不能有效的解决以上问题。

针对上述问题，本专利提供了一种化学偶联蛋白质与胶乳微球的新方法，有效的解决了上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羧化聚苯乙烯微球上化学偶联抗体的方法。本方法采用具有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球，应用化学法将蛋白质(抗体或抗原)偶联于微球表面，制备得到胶乳增强免疫检测试剂。由于采用了具有间隔臂的胶乳微球，微球上的间隔臂对蛋白质起到了一定的支撑作用，从而使其活性位点尽量暴露，提高了抗体的利用率。同时该工艺改进了制备方法，在将偶联了抗体的胶乳微球与残余的抗体分离时采用了切向流过滤技术，克服了离心分离工艺中的胶乳微球聚集以及后续的胶乳微球的超声再分散的问题，从而避免了抗体的脱落和失活。同时更有利于放大生产。采用该工艺制备的检测试剂具有很好的灵敏度和长期稳定性。

本发明是通过下述技术方案加以实现的：

本发明的羧化聚苯乙烯微球偶联蛋白质的方法，包括：微球的活化，蛋白质的偶联，切向流过滤分离残留的抗体与胶乳微球，以及微球的封闭四个步骤。

1)微球的活化；采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧化聚苯乙烯微球，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基；

2)蛋白质的偶联；

3)切向流过滤分离残留的抗体与胶乳微球；

4)以及微球的封闭四个步骤。

所述的步骤1)采用如下方法：

取0.5-2.5ml浓度为1％-5％质量分数的具有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球，加去离子水或蒸馏水稀释到0.5-2倍后，分别加入20-180μl 1mg/ml的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应10-40min。

所述步骤2)采用如下方法：