[发明专利]可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌及其构建与发酵方法，尤其是涉及一种可增强氧吸收能力的基因重组多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法。 

背景技术

化学农药已经应用了半个多世纪，给农业带来了巨大的经济效益。然而，在农作物种植中滥用化学农药，引起有害昆虫的抗药性日益增强，使农药防治各种害虫的效果明显下降，同时残留量大，威胁人类健康，造成环境污染。生物农药或绿色农药是未来农药发展的必然趋势，也是农业可持续发展的一项基本保证。 生物农药的优势在于：1）有很高的生物活性，药效高，单位面积使用量少；2）选择性强，对益虫和非靶标生物无毒或毒性很小；3）对农作物无害；4）使用后在农作物体内外、农产品以及土壤、大气、水体无残留或即使有微量残留也可在短期内降解，生成无毒的天然物质而对环境无害。 

多杀菌素是刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）经有氧发酵产生次生代谢产物，它是一类大环内酯物质，在功能上具有杀虫的重要作用，最初被命名为A83543因子。Spinosyn家族化合物中主要的活性组份为 Spinosyn A和Spinosyn D（合称spinosad）。前人研究表明，多杀菌素与鳞翅目、缨翅目等靶标害虫有2个作用位点即γ-氨基丁酸受体（Gamma-amino butyric acid receptors， GABARs）和烟碱乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors， nAchRs)，具有摄食毒性和快速触杀双重作用，对非靶标生物的毒性很低， 对人和其他哺乳动物非常安全，迄今为止没有发现与其他杀虫剂有交叉抗性。多杀菌素因兼具化学农药的快速性与生物农药的安全性，已被广泛用于农业害虫与动物寄生虫病防治，成为目前国际上极具发展前景的生物杀虫剂。 

然而，野生型刺糖多孢菌的多杀菌素生物合成量很低，为提高其产量的菌种遗传改良成为当前的研究热点，已有利用传统的理化诱变结合高通量筛选，原生质体再生，原生质体属间融合，多杀菌素生物合成相关基因加倍等方法进行其菌种遗传改良的相关报道。刺糖多孢菌发酵过程中菌体呈丝状增长，且多杀菌素的生物合成需要脂肪酸作为前体，发酵生产中常添加一定量的油脂，导致菌体发酵液十分粘稠，供氧不足，成为限制多杀菌素生物合成的主要因素之一。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种多杀菌素生物合成效率高的可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法。 

本发明的技术方案是： 

本发明之可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌系应用基因重组技术，将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）整合到刺糖多孢菌染色体组构建的基因重组多杀菌素工程菌，其分类名称为放线菌刺糖多孢菌S078-1011（Saccharopolyspora. spinosa S078-1011），于2011年11月20日保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC；地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:2011400。

本发明之多杀菌素工程菌的构建方法包括以下步骤： 

（1）采用重叠PCR方法，将透明颤菌血红蛋白基因vgb的ORF置于PermE之下，连接至pSET152载体，获得整合型载体pSET152EVHB；

（2）整合型载体pSET152EVHB热激转化E. coli ET12567 /pUZ8002，获得转化子E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB)；

（3）供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB)与受体菌刺糖多孢菌SP06081属间接合转移，获得重组菌株，命名为放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011。

（4）重组菌株放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011的PCR 与 Southern blotting 鉴定； 

（5）VHb在重组刺糖多孢菌内生物学活性进行检测；

（6）检测VHb 表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素合成的影响；

（7）对不同溶氧条件下，重组菌株多杀菌素产量进行分析；

（8）对重组菌株的遗传稳定性进行分析。

本发明之利用所述多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌S078-1011进行发酵的方法： 

（1）菌种活化