[发明专利]可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法

权利要求书

1.一种可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌，其特征是，利用基因重组技术，将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）整合到刺糖多孢菌染色体组构建的基因重组多杀菌素工程菌，其分类名称为放线菌刺糖多孢菌S078-1011（Saccharopolyspora. spinosa S078-1011），保藏编号为CCTCC NO:2011400。

2.一种权利要求1所述多杀菌素工程菌的构建方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）采用重叠PCR方法，将透明颤菌血红蛋白基因vgb的ORF置于PermE之下，连接至pSET152载体，获得整合型载体pSET152EVHB；

（2）整合型载体pSET152EVHB热激转化E. coli ET12567 /pUZ8002，获得转化子E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB)；

（3）供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB)与受体菌刺糖多孢菌SP06081属间接合转移，获得重组菌株，命名为放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011，

（4）重组菌株放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011的PCR 与 Southern blotting 鉴定；

（5）VHb在重组刺糖多孢菌内生物学活性进行检测；

（6）检测VHb 表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素合成的影响；

（7）对不同溶氧条件下，重组菌株多杀菌素产量进行分析；

（8）对重组菌株的遗传稳定性进行分析。

3.一种利用权利要求1所述多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌S078-1011进行发酵的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）菌种活化

 将保藏的增强氧吸收能力的放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011划线接种个于固体种子培养基斜面上，30℃培养5-7天，配制孢子悬液，按体积比4-6%接种量转接种子活化培养基，在30℃条件下300rpm摇瓶振荡培养48h，以体积比10%的接种量用于种子罐接种；

（2）灭菌及培养条件

上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5 kg/cm²条件下灭菌30 min；

（3）种子罐发酵

 先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃灭菌30min， 装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按体积比10%接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液；

（4）生产发酵罐

 培养前先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25~30℃，按体积比10%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；

（5）浓缩

发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩，补加增效添加剂、随后装瓶；

（6）培养基配方：

1）种子斜面培养基（g / L）：酪蛋白胨30，酵母提取物3，MgSO₄·7H₂O 2，葡萄糖5，麦芽糖 4，琼脂 18；121℃ 灭菌20 min；

2）种子活化培养基（g / L）: 葡萄糖 10， 酪蛋白胨 3， 酵母提取物 10，磷酸二氢钾 0.5；115℃ 灭菌25 min；

3）20L发酵罐培养基(g / L)：葡萄糖 100，豆饼粉 6，棉子粉 10，豆油5，玉米粉 8，碳酸钙 4，酵母粉 1，消前pH 7.0，培养温度为24~33 ℃，而合成 多杀菌素的最适宜温度为30~32℃；发酵时用通气量和搅拌速率来维持溶氧在50%以上；罐压为0.034Mpa。