[发明专利]经修饰流感血凝素蛋白及其用途

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年12月22日提交的美国临时申请流水号61/426,390的优先权，在此通过述及将其完整收录用于所有目的。

技术领域

一般而言，本发明涉及经修饰流感血凝素(HA)蛋白及用于生成和使用它们的方法，包括它们在用于治疗和/或预防流感感染的免疫原性组合物诸如疫苗中的用途。

电子提交的文本文件的描述

通过述及将随本文电子提交的文本文件的内容完整收入本文：序列表的计算机可读形式拷贝（文件名：NOVV_046_00US_SeqList_ST25.txt，记录日期：2010年10月29日，文件大小：10千字节）。

发明背景

流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的一个成员，而且含有分段的负义RNA基因组。流感病毒体包括下述蛋白质：血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)，基质(M1)，质子离子通道蛋白(M2)，核蛋白(NP)，聚合酶碱性蛋白1(PB1)，聚合酶碱性蛋白2(PB2)，聚合酶酸性蛋白(PA)，和非结构蛋白2(NS2)。HA、NA、M1、和M2蛋白是膜相关的，而NP、PB1、PB2、PA、和NS2是与核壳相关。NS1是不与病毒体颗粒结合而是特异于流感病毒感染细胞的唯一非结构蛋白。HA蛋白是一种包膜糖蛋白，负责病毒附着至宿主细胞且是病毒中和和保护性免疫力的免疫显性表位的一个主要来源。因而，由于相对有力的免疫原性，HA蛋白被认为是预防性流感疫苗的一种重要成分。

目前得到许可的掺有HA的疫苗包括灭活甲型和乙型流感病毒疫苗（例如供胃肠外施用的三价疫苗）。现有的商品化流感疫苗是全病毒(WV)或亚病毒体(SV)病毒疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒体，而SV疫苗经过溶剂处理且含有几乎所有病毒结构蛋白和一些病毒包膜。而且，在用去污剂处理SV病毒并进一步纯化时，它主要含有HA、NA、和NP蛋白的聚集物。

在包含HA的减毒WV或SV流感疫苗之外，已经开发了数种重组HA产品作为疫苗候选。这些办法集中于流感HA蛋白的表达、生成、和纯化，包括使用受杆状病毒感染的昆虫细胞表达这些蛋白质。

最近，生成更加有效的疫苗的尝试集中于与一种或多种别的病毒蛋白（例如流感M1和/或NA）联合表达HA以形成蛋白质高分子颗粒，诸如病毒样颗粒(VLP)(Pushko et al.,2005,Vaccine 23:5751-9)。VLP模拟病毒颗粒的整体结构，无需含有潜在感染性物质。VLP缺少病毒DNA或RNA基因组，但是保留真实病毒的三维结构。

虽然当前使用的含有HA的流感VLP在预防性施用后得到较好耐受，但是这些VLP疫苗在某些群体中展现出可疑的功效，特别是年轻人、老年人、和具有慢性医学状况的个体。因而，需要改良的流感VLP疫苗以用于这些高度易感的患者群体。通过开发诱导增强的免疫原性（特别是在流感VLP的背景中表达时）的流感HA蛋白，本发明的发明人解决了这种需要。

发明概述

本发明人观察到自流感血凝素(HA)蛋白消除一个或多个糖基化位点令人惊讶地改进HA蛋白诱导免疫应答的能力。此外，本发明人观察到当在流感VLP的背景中表达时，经修饰而消除一个或多个糖基化位点的HA蛋白仍然维持它们的构象结构且出乎意料地保留它们与其它流感病毒蛋白质诸如M1和NA相互作用的能力。当在适宜的表达系统中生成时，此类糖基化位点修饰会因此一般性改进基于HA的流感疫苗（例如流感VLP疫苗）的免疫原性。如此，这项发现也减轻每剂疫苗要使用的病毒抗原的量的需要且伴随着导致制造的每批疫苗的疫苗产量升高。

因而，一方面，本发明提供经修饰而自HA蛋白上的位置（即糖基化位点处）消除一个或多个聚糖的血凝素(HA)蛋白。此类经修饰HA蛋白预期能诱导比它们的未修饰对应物更强的针对流感病毒感染的免疫应答。可以在HA蛋白的球状头中或主干区中找到为消除选择的聚糖。在一个具体的实施方案中，在球状头的受体结合域(RBD)内找到消除靶向的多个聚糖之一。在本文中描述的各种实施方案中，要消除的聚糖是N连接的聚糖（即附着至天冬酰胺或精氨酸侧链的氮的聚糖）。