[发明专利]亲和色谱基质

说明书

发明领域

本发明涉及亲和色谱法领域，且更具体涉及含有配体的分离基质，所述配体含有一个或多个蛋白A结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z，其中在至少一个结构域(单体)中，对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z的H18的位置上的天冬酰胺或组氨酸已被取代为另一种氨基酸。本发明亦涉及用具有增加洗脱pH的优势的前述基质分离目标蛋白质的方法。

发明背景

免疫球蛋白为全球范围内生产或研发中最普遍的生物制药产品。此特定治疗市场的高度商业化需求和由此带来的价值已导致制药公司将重点放在将其各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。

在大多数情况下将亲和色谱法用作这些免疫球蛋白分子(例如单克隆或多克隆抗体)纯化中的关键步骤之一。特别令人关注的一类亲和试剂为能够与免疫球蛋白分子的恒定部分特异性结合的蛋白质，这类相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。这类试剂可广泛用于从不同样品中用亲和色谱法回收免疫球蛋白，所述样品例如但不限于血清或血浆制品或来源于细胞培养物的原料。所述蛋白质的一个实例为葡萄球菌蛋白A，其含有能够与来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分结合的结构域。

因其高亲和力和选择性所致，基于葡萄球菌蛋白A (SpA)的试剂已在生物技术领域发现了广泛的用途，例如在用于捕获和纯化抗体以及检测的亲和色谱法中发现了广泛的用途。目前，基于SpA的亲和介质可能是用于从不同样品中分离单克隆抗体及其片段的最广泛使用的亲和介质，所述样品包括来自细胞培养物的工业原料。因此，各种包含蛋白A配体的基质可市购获得，例如以天然蛋白A的形式(例如Protein A SEPHAROSE^TM, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，还包括重组蛋白A (例如rProtein A SEPHAROSE^TM, GE Healthcare)。更具体地说，在商业重组蛋白A产品中进行的基因操作目的在于利于其附着至支持物。

这些应用，与其他亲和色谱法应用相似，需要广泛关注污染物的明确去除。这类污染物可例如为色谱程序中吸附至固定相或基质的非洗脱分子，例如非所需的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。通常在所需产品的第一次洗脱之后从基质中去除这类污染物，以便于在后续使用之前使基质再生。这类去除通常包括称为原位清洗(cleaning-in-place，CIP)的程序，其中使用能够从固定相上洗脱污染物的试剂。常常使用的一类所述试剂为流过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洗和清洁剂为NaOH，其浓度范围可为0.1 M直至例如1 M，这取决于污染的程度和性质。此策略涉及将基质暴露于超过13的pH值。对于含有蛋白质性质的亲和配体的许多亲和色谱基质而言，这类碱性环境为非常苛刻的条件并因此由于配体对有关高pH的不稳定性而导致能力下降。

因此，广泛的研究已集中在工程改造蛋白质配体的开发上，所述蛋白质配体显示出耐受碱性pH值的能力提高。例如，Gülich等(Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178)提出改进链球菌白蛋白结合域(ABD)在碱性环境中的稳定性的蛋白质工程。Gülich等创建了ABD的突变体，其中所有的4个天冬酰胺残基被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)取代。另外，Gülich等报道，其突变体显示出与天然蛋白的靶蛋白结合性能相似的靶蛋白结合性能，并且与使用亲本未工程改造的配体制备的柱相比，含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露给碱性条件之后显示更高的结合能力。因此，从中推断可在对结构和功能无任何显著影响的情况下取代所有的4个天冬酰胺残基。

近期研究表明亦可对蛋白A (SpA)作出改变来产生类似特性。美国专利申请2005/0143566公开了将至少一个天冬酰胺残基突变成除谷氨酰胺或天冬氨酸之外的氨基酸时，与亲本SpA (例如SpA的B结构域)或蛋白Z (来源于SpA的B结构域的合成构建体(US 5,143,844))相比，所述突变赋予了在高达约13-14的pH值下增加的化学稳定性。作者显示当这些突变的蛋白质用作亲和配体时，正如预期的分离介质可更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序。美国专利申请2006/0194955显示突变的配体可更好地耐受蛋白酶从而减少分离过程中的配体漏失。另一个美国专利申请2006/0194950显示可进一步修饰碱稳定的SpA结构域以使配体缺失对Fab的亲和力但保留Fc亲和力，例如通过G29A突变。