[发明专利]寡核苷酸标记及其鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸标记及其鉴定方法。

背景技术

寡核苷酸具有独特的优势，这是由于它们即使以很少的量存在也可通过聚合酶链式反应(PCR)大量扩增，并且其原始的核苷酸序列可通过核苷酸测序确定。因此，当将很少量的这种寡核苷酸添加至多种物质或产品(包括油、涂料(paint)、爆炸物和艺术品)时，可以精确地测定物质或产品的最初来源或运输途径，或者产品是否真实的。

一般使用添加荧光剂、色素或特定化学物质的方法来标记油产品。但是问题在于：很难对很少量的样品进行定量分析，很难对多种产品进行标记，操作者可造成污染，并且可进行变造(manipulation)例如移除标记。

用于寡核苷酸合成仪的标准合成法是亚磷酸三酯法。在亚磷酸三酯法中，形成DNA结构骨架的磷酸二酯键使用β-氰乙基亚磷酰胺产生。在该方法中，从连接有核苷的固体支持物开始，通过重复由去保护(deblocking)、偶联、加帽和氧化组成的合成过程来合成具有期望长度的寡核苷酸。作为合成过程的第一步的去保护步骤起始于使DMT从固体支持物上脱离，去保护步骤生成的5′-羟基与核苷亚磷酰胺单体发生偶联反应，以合成具有期望核苷酸序列的寡核苷酸。去保护步骤在酸性条件下使用三氯乙酸或二氯乙酸进行。偶联步骤后，未反应的5′-羟基可以参与下一偶联步骤以生成具有不期望核苷酸序列的(n-1)mer，因此，使未反应的5′-羟基通过用乙酸酐和N-甲基咪唑乙酰化进行加帽。偶联步骤得到的结构为亚磷酸酯，用碘将其氧化以将其转化成磷酸酯形式，这是实际DNA结构的一部分。重复上述合成过程使得合成具有期望长度的寡核苷酸。合成完成后，用氨处理使合成的寡核苷酸从固体支持物上脱离，β-氰乙氧基被从中去除，从而使得所合成的寡核苷酸恢复为形成DNA结构骨架的磷酸二酯键。

由于在中性pH下磷酸二酯键带负电，所以由多个磷酸二酯键组成的寡核苷酸显示强亲水性。

因此，寡核苷酸易溶于水溶液，但一般不溶于有机溶剂。该特性导致寡核苷酸溶解于有机溶剂中时溶解度低的问题。

对于使用这种DNA标记对象的方法，WO87/06383公开了可作为标记使用的核苷酸，但未公开通过DNA扩增或测序鉴定对象的方法，并且未公开在有机溶剂中溶解亲水性DNA的方法。WO90/14441公开了使用去污剂将DNA溶于油中，从而将亲水性DNA引入有机层的技术。然而，WO90/14441仅公开了使用特定引物检测DNA是否扩增来确定DNA存在与否。而且，其未提及使用DNA的核苷酸序列作为鉴定标记。此外，使用去污剂时，DNA在有机层中以反向胶束的形式存在，以致其聚集而不是在分子水平上分散。另外，以反向胶束形式引入有机层的DNA可容易地被提取至水层，从而可能被去除。

WO91/17265公开了通过用特定引物(WO90/14441中描述的)扩增基因来确定基因的核苷酸序列，还公开了DNA可与固体支持物或物质共价连接。对于WO91/17265的公开，当核苷酸直接与涂料或油成键时，在提取和收集寡核苷酸的过程中共价键会被破坏，从而改变核苷酸。因此，寡核苷酸不能扩增为准确序列，因此它们难以被商业化。

WO94/14918公开了基因扩增和测序的更为改进的方法，其使用两种或更多种发光物质或显色化合物作为标记。然而，该方法也未考虑到寡核苷酸的羟基或核苷酸的氨基的反应性。由于羟基或氨基部分的反应，在进行聚合酶链式反应(PCR)或核苷酸测序时无法得到具有原始序列的寡核苷酸。

美国专利No.5665538公开了监测水溶液中石油物质运动的方法，包括在石油物质中添加微轨迹添加剂(microtrace additive)。使用DNA以0.01-1000pg/DNA/μl的终浓度将微轨迹添加剂加入至石油物质中。将DNA配制为可溶于石油物质，从而微轨迹添加剂的疏水性使其分配到石油物质中。该制剂确保DNA溶解于或分散于石油物质中，从而使得其基本上不被水性清洗除去。含微轨迹添加剂的石油物质在其移动后取样，然后将微轨迹添加剂从石油物质中取出，最后通过扩增反应对DNA微轨迹添加剂进行检测。

美国专利公开2007/0065876公开了标记系统，其包含具有不同大小的寡核苷酸的组合。每个DNA包括三个片段，其中中间片段具有根据寡核苷酸的长度而不同的长度，从而使得这种不同的长度作为编码，并且两个末端片段为具有不同序列的引物。引物作为检测元件来确定物质的存在与否。寡核苷酸DNA通过扩增进行检测。