[发明专利]用于使多种逆转录病毒毒株中的不对称靶位点重组的修整重组酶

说明书

本发明涉及用于制备编码修整重组酶(tailored recombinase)的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使可插入宿主细胞基因组中的多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的长末端重复序列(LTR)内的不对称靶序列重组，以及涉及所获得的表达载体、用所述表达载体转染的细胞、表达的重组酶和包含所述表达载体、细胞和/或重组酶的药物组合物。药物组合物可用于例如治疗和/或预防逆转录病毒感染。特别地，公开了存在于多种HIV-1毒株中的不对称靶序列，以及能够使这些序列重组的修整重组酶(Tre 3.0和4.0)和编码所述修整重组酶的表达载体。

技术背景

逆转录病毒感染例如被人免疫缺陷病毒(HIV)感染仍是最重要和最普遍的人类疾病之一。

治疗逆转录病毒(例如HIV)的一种方法是靶向插入宿主细胞基因组中的原病毒。将原病毒DNA从宿主基因组上切除可防止例如HIV进一步复制，而且不同于现有方法，因为它具有根除甚至是存在于宿主基因组中的潜伏病毒的潜力。

考虑用于这种备选方法的一类蛋白质是位点特异性重组酶(Flowers等，1997)。位点特异性重组酶事实上介导从基因重排到基因组分离的许多功能，例如限定DNA单位的切除、倒位或整合(有关综述参见Stark等，1992)。

最简单和最被了解的重组酶之一是来自噬菌体P1的Cre重组酶，其通过特定序列的两个相同的双链DNA位点之间的重组使基因组二聚体解离成单体(Hoess和Abremski，1985)。Cre重组酶已广泛用于小鼠遗传学(NAGY，2000)。Cre是以其功能命名的38 kDa蛋白质，因为它引起重组(causes recombination) (Sternberg和Hamilton，1981)。这种重组的先决条件是在反向平行方向上由Cre识别的两个重组位点的排列，所述重组位点随后被连接构成环的4个相同的Cre亚基结合，其中每个亚基接触2个邻近亚基和一个重组位点的一半位点(Hoess和Abremski，1985)。被Cre识别的重组位点是称为loxP (出自locus of crossing over (x)，P1 (交换(x)的基因座P1)；Sternberg和Hamilton，1981)的34-bp双链DNA序列，除了其8个最里面的碱基对(称为间隔区)外，它是回文的，所述8个最里面的碱基对赋予位点方向性。

一些位点特异性重组系统包括Cre/loxP系统，无需辅助蛋白质或辅因子而发挥作用，并且在广泛多样的细胞条件下发挥作用。然而，因为位点特异性重组酶通过重组酶亚基与其关联DNA靶序列的特定相互作用而发挥作用，所以这些酶的使用受以下必要条件的限制：被靶向的DNA区域必须含有适当定位的靶位点(LEWANDOSKI，2001)。迄今为止，尚未鉴定识别天然逆转录病毒序列作为其DNA靶序列的野生型重组酶。

近年来已进行了大量的位点特异性重组酶的突变和结构分析，以改变其性质，并实现对这些酶的复杂机制的更好理解(有关综述参见van Duyne，2001；以及Coates等，2005)。许多研究集中于Cre重组酶以探究其可进化性(evolvability)。几项研究证实，当Cre在其loxP识别位点中的少数核苷酸改变时，Cre靶向特异性可被改变(BUCHHOLZ和STEWART，2001；SANTORO和SCHULTZ，2002；RUFER和SAUER，2002)。进一步的研究致力于工程改造含有来自HIV-1 LTR的序列的突变loxP靶位点，以开发可能的靶位点用于使用Cre作为抗病毒策略(Lee和Park，1998；Lee等，2000)。