[发明专利]用于使多种逆转录病毒毒株中的不对称靶位点重组的修整重组酶

权利要求书

1. 用于制备编码修整重组酶的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，所述方法包括以下步骤：

(a) 鉴定与多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR序列中的至少一个已知重组酶靶位点的左半位点序列和右半位点序列具有至少30%同源性的序列，其中同源序列被5-12个核苷酸的间隔区分隔开，且其中不对称靶序列存在于多种逆转录病毒毒株中；

(b) 鉴定两种序列，其中第一序列对应于与所述已知靶位点的左半位点同源的步骤(a)的不对称靶序列的序列，称为“半位点序列1”，其中第二序列对应于与右半位点同源的步骤(a)的不对称靶序列的序列，称为“半位点序列2”；

(c) 确定偏离步骤(a)的至少一个已知同源靶位点的相应的同源左半位点和右半位点序列的步骤(b)序列内的核苷酸；

(d) 产生包含靶序列的两种靶核酸的第一亚组，其中第一靶序列称为亚位点1，包含彼此邻接且按5'至3'顺序的步骤(b)的半位点序列1、不对称靶序列的间隔区序列和半位点序列1的反向重复序列，且其中第二靶序列称为亚位点2，包含彼此邻接且按5'至3'顺序的半位点序列2的反向重复序列、不对称靶序列的间隔区序列和步骤(b)的半位点序列2；

(e) 在步骤(d)的第一亚组中的靶序列的基础上，产生包含修饰靶序列的靶核酸的第二亚组，

其中，在基于亚位点1的序列中，在左半位点序列中，偏离步骤(a)的至少一个已知靶位点的相应的同源半位点序列的核苷酸的一部分被存在于所述已知靶位点中的天然核苷酸置换，直到所述半位点序列含有1、2或3个偏离所述已知靶位点的核苷酸，其中所述修饰靶序列的右半位点通过所述修饰左半位点序列的反向重复而形成，其通过不对称靶序列的间隔区序列而与所述修饰左半位点序列分隔开，和

其中，在基于亚位点2的序列中，在右半位点序列中，偏离步骤(a)的至少一个已知靶位点的相应的同源半位点序列的核苷酸的一部分被存在于所述已知靶位点中的天然核苷酸置换，直到所述半位点序列含有1、2或3个偏离所述已知靶位点的核苷酸，其中所述修饰靶序列的左半位点通过所述修饰右半位点序列的反向重复而形成，其通过不对称靶序列的间隔区序列而与所述修饰右半位点序列分隔开，

使得合起来看，在来源于步骤(d)的第一亚组的一种靶序列的所有修饰半位点序列中，可找出所有的偏离核苷酸，但是所述修饰半位点序列无一单独包含所有的偏离核苷酸，

(f) 使用步骤(e)中获得的第二亚组的每种核酸作为底物，分别将分子定向进化应用于识别步骤(a)的已知同源靶位点的至少一种重组酶；

(g) 改组步骤(f)中进化的重组酶文库，其中将在基于亚位点1的序列上进化的所有重组酶文库组合并改组，且其中将在基于亚位点2的序列上进化的所有重组酶文库组合并改组；

(h) 使用步骤(d)的亚组的每种核酸作为底物，将分子定向进化应用于步骤(g)中所获得的改组文库；

(i) 改组在步骤(h)中进化的重组酶文库；

(j) 使用包含步骤(a)的不对称靶序列的核酸作为底物，将分子定向进化应用于步骤(g)中所获得的改组文库，直到获得对步骤(a)的逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性的至少一种重组酶；

(k) 从文库中分离编码在步骤(j)中获得的至少一种重组酶的核酸；和

(l) 将步骤(k)中获得的核酸克隆到合适的表达载体中。

2. 权利要求1的方法，其中所述逆转录病毒是HIV，优选HIV-1。

3. 权利要求2的方法，其中所述逆转录病毒是HIV-1，所述不对称靶序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。

4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中其靶序列用于步骤(a)且在步骤(f)中对其进行分子定向进化的至少一种已知重组酶是重组酶文库的一部分。

5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所采用的分子定向进化是底物关联的蛋白质进化。

6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤(l)中的表达载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、泡沫病毒载体和腺病毒载体。