[发明专利]单克隆抗体在纤毛虫宿主细胞中的表达

说明书

本发明涉及用于在纤毛虫宿主细胞中异源表达单克隆抗体(mAb)的系统。

现今，用于人类治疗的单克隆抗体的主要适应症是癌症、自身免疫疾病和传染性疾病。

一种作用机制为中断促进肿瘤相关性血管生成的生长因子的信号传导通路，从而饿死肿瘤，例如靶向血管内皮生长因子(VEGF)的阿瓦斯丁(Avastin)(贝伐单抗(Bevacizumab))所作用的那样。其他靶标有例如胎盘生长因子(PLGF)。为了这些目的，由位于抗体轻链和重链(V_L和V_H)可变区的互补决定区(CDR)区域介导的高靶标亲和力是必需的，但由Fc区发挥的抗体效应分子功能不是关键性的。为了这些目的，可以利用缺乏Fc区的抗体片段(如scFv或Fab)。

其他作用机制是结合如TNFα(阿达木单抗(Humira))的细胞因子，或者阻断如erbB-2(爱必妥(Erbitux))的生长因子受体、阻断如RSV F-蛋白(帕利珠单抗(Synagis))的进入细胞所需的病毒表面抗原、或者阻断负责血液凝结的受体，如RBC的IIb/IIIa-受体(阿昔单抗(ReoPro))。

然而，单克隆抗体还可以用于靶细胞杀伤的应用，例如用于消除癌细胞或病原体。尽管已经开发了偶联抗体，即携带特定细胞毒素的人工抗体用于该目的，缺乏特定细胞毒素的非偶联抗体也能够通过引起各自的免疫反应满足该目标。然而，为了这些目的，功能性Fc区是必需的，其存在于IgG，特别是IgG1中。基本上，就此已知四种不同机制：

．靶细胞结合抗体的Fc区能够结合免疫效应细胞表面上的Fcγ受体(FcγR，特别是FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII)，以及通过免疫效应分子触发FcγR-介导的靶细胞杀伤(“抗体依赖性细胞的细胞毒作用”，或ADCC)；

·靶细胞结合抗体的Fc区能够结合血液中存在的补体系统的可溶性蛋白(例如，C1q)，并且触发补体介导的靶细胞溶解(“补体依赖性细胞毒作用”,CDC)；

·抗体与靶分子的直接结合能够触发细胞死亡诱导机制，诸如细胞凋亡(抗体依赖性细胞凋亡)，或者能够阻断细胞存活因子诸如生长因子的作用；

·通过抗体介导的巨噬细胞或嗜中性细胞的结合以及随后的吞噬作用对靶细胞的调理作用。

ADCC是细胞介导的免疫机制，据此免疫系统的效应细胞主动溶解已被特异性抗体结合的靶细胞。它是抗体作为体液免疫反应部分能够发挥作用以限制和牵制感染的机制之一。经典的介导ADCC的效应细胞是自然杀伤(NK)细胞；但单核细胞和嗜酸性细胞也能够介导ADCC。由于ADCC依赖在先的抗体反应，它是适应性免疫反应的一部分。

用于引发靶细胞内ADCC的治疗性抗体需要Fc以便被上述效应细胞的Fcγ受体识别。这种抗体的实例有识别erbB-2并优先结合肿瘤细胞过表达的erbB-2的赫塞汀(Herceptin)，或者结合恶性B-细胞中CD20受体的利妥昔单抗(Rituxan)。

另一潜在的机制是将两个或更多个不同实体密切靠近，即通过利用双-或更高特异性的抗体构建体将两个或更多个不同实体密切靠近。例如，这对于将T细胞重定向于肿瘤细胞是有用的，在肿瘤细胞得以逃脱T细胞攻击的情况下，例如通过它们MHC I类实体的突变或缺失，或通过分泌抑制T细胞活化的信使物质得以逃脱T细胞攻击的情况下。一种方法是联合两个scFv抗体，其中一个针对T细胞受体(例如，CD3)，而另一个针对肿瘤细胞抗原(例如，EGFR)。

另一种方法是连接(借助包含两个Fv链中两个不同互补决定区和Fc-区的融合分子)肿瘤细胞(例如，借助结合至EGFR或EpCAM的Fv)、T细胞(例如，借助结合至T细胞受体如CD3的另外Fv)和效应细胞,诸如单核细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞(借助由这类效应细胞上的Fc γ受体检测到的Fc区)。该方法将诱导肿瘤细胞溶解和凋亡的T杀伤细胞和效应细胞的抗肿瘤效应集合在一起，效应细胞通过吞噬作用或细胞凋亡消除肿瘤细胞，同时它们释放进一步激活T细胞活性的细胞因子。

另一种方法是设计抗体，其中两个不同的抗原能够被一个抗原结合位点识别，并都具有高亲和力。将来这种抗体可以取代两种不同抗体的组合疗法。此外，这种抗体还能够用于联合同一抗原特别是可溶性抗原的不同表位，从而增加结合亲合力和体内效价。

目前，用于治疗用途的抗体或者其片段或衍生物被表达在大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞系如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中。这些系统不容许增强ADCC或提供多重特异性的抗体，并且有一些其他缺点。