[发明专利]缀合的凝血因子VIIa

说明书

技术领域

本发明涉及一种缀合形式的人凝血因子VIIa。

背景技术

凝血因子VII（本文中称作FVII）是一种分子量为53000道尔顿（Da）、被糖基化的维生素K依赖性的单链酶原，凝血因子VII含有12个天然的二硫键（O’Hara et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.美国，84:5158-5162(1987))）。蛋白质主要是在肝脏中产生。FVII参与外源性凝血级联反应（图1）。所述蛋白质由四个离散的结构域组成：一个N-末端γ-羧基谷氨酸（Gla）结构域，两个类表皮生长因子（EGF）结构域和一个C-末端丝氨酸蛋白酶结构域。当缺乏存在于血管内皮下膜中的FVII的辅因子组织因子（TF）时，血液循环中的酶原仅表现出很低的蛋白酶活性。血管损伤后，FVII以高亲和力与TF结合，并通过精氨酸152和异亮氨酸153之间肽键的特异性裂解，变成有活性的双链酶FVIIa。FVIIa轻链由N-末端Gla结构域和类EGF结构域构成，重链由丝氨酸蛋白酶结构域构成。重链和轻链通过半胱氨酸135和半胱氨酸262之间的单一二硫键连接在一起。一旦被活化，FVIIa会快速地催化FX转化为FXa并催化FIX转化为FIXa。然后，FXa与FVa形成一种复合物，以使凝血酶原裂解，这会产生少量的凝血酶(Aitken,M.G.EMA,16:446-455(2004))。这种凝血酶的产生会使血小板和血小板表面上的辅因子V，VIII和XI活化。这样的活化会导致凝血酶的大量形成，所述凝血酶的大量形成能够引起纤维蛋白聚合反应和止血栓塞的形成。

诺和诺德公司已经研发出了人重组FVIIa并已将其商品化，其商品名为(活化形式的eptacog alfa，ATC编码B02BD08)。被批准用于治疗血友病A或B患者的出血发作（bleeding episodes），所述患者分别能够产生FVIII或IX的抑制性抗体(Jurlander et al.,Seminars inThrombosis and Hemostasis,27:373-383(2001);Roberts et al.,Blood,15:3858-3864(2004))。自1996年开始使用时起，已经证明这样的治疗是安全和有效的。然而，由于蛋白质在体内半衰期相对较短（2.3小时；以批准的为基础的概要，FDA的序列号为96-0597），为了达到止血的目的，在一次出血发作过程中随着时间的推移，需要多次输入高剂量的产品(90μg kg^-1)。所述产品较短的半衰期和达到理想的治疗效果所需要的高剂量阻碍了与抑制剂共同使用在预防性治疗血友病患者中的用途。因此，很明显需要开发一种半衰期更长的FVIIa分子，以便在药物动力学（PK）和药效动力学（PD）方面都有所改进。

以前，人们就已经成功的将生物药品与生物相容性聚合物相缀合以用于提高产品的物理化学特性。通过缀合被改进的治疗性蛋白的特性包括PK、PD和免疫原性。化学基团与蛋白质的连接能够显著地增加蛋白质的循环半衰期(Jevsevar et al.,Biotechnol.J.,5:113-128(2010))。对于分子量低于肾小球过滤限制的分子种类来说，大分子量基团的缀合阻碍了产品的肾清除。而且，在药剂制品上附加化学基团能够通过空间位阻来阻碍受体介导的分子清除。

已在许多市售的生物药品制品中使用的生物相容性聚合物的实例是聚乙二醇（本文中称作PEG）。将PEG分子共价附着到另一个分子的过程称作聚乙二醇化。迄今为止，有九种聚乙二醇化的制品已经获得FDA的上市许可，其中有四种是非常畅销的药品：(Schering-Plough)、(Hoffman-La Roche)、(Amgen)和(Hoffman-LaRoche)。已经有许多不同的化学方法用于将蛋白治疗剂与活化的PEG分子相缀合。随机的聚乙二醇化已经成功地被用于通过蛋白质上的氨基将PEG基团与蛋白共价连接。这种连接位点通常是但不仅仅限于赖氨酸残基侧链上的ε-氨基。这种随机的反应可能产生非常复杂的缀合物的混合物，其中的PEG部分附着位点和数目都不尽相同。即使在随机缀合反应后进行纯化，也还会存在位置异构体，而这些异构体均具有不同的物理化学性质和药物学性质。目前已经研发了多种位点特异性的聚乙二醇化技术，并且现在已经试图将这些技术用于生产成分更确定的生物药品。进行位点特异性聚乙二醇化所采取的方法包括靶标于N-末端、半胱氨酸、聚糖、二硫化物和聚组氨酸的聚乙二醇化。

重组FVIIa的聚乙二醇化的现有技术在不同的专利和专利申请中均有记载：