[发明专利]用于活化和缀合生物分子的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于生成生物分子缀合物的方法，其中将该方法整合入单一单元操作(single unit operation)中。

发明背景

随着生物技术的进展，已经开发出生物药物来满足未满足的医学需要。然而，其短的体内半衰期需要患者服用频繁和/或大剂量的这些生物药物来实现靶标治疗或预防目的。长的静脉内疗法或频繁的注射可以影响患者的生命质量。多种聚合物诸如聚乙二醇(PEG)可以与生物分子(例如，蛋白质)缀合以提高许多生物分子的半衰期和生物活性(Reddy,Ann.Pharmacother.34:915-923,2000)。聚合物缀合物的其它益处包括(a)在制造过程期间改善的产品稳定性；(b)降低的肾清除(Fung等,Polym.Prepr.38:565-566,1997)；改善的肿瘤靶向(Yowell等,Cancer Treat.Rev.28Suppl.A:3-6,2002)；降低的抗原性和免疫原性(Muller等,Br.J.Haematol.110:379-384,2000;Abshire等,Blood96:1709-1715,2000)；和更大的可耐受性(Safra等,Ann.Oncol.11:1029-1033,2000;Judson等,Eur.J.Cancer 37:870-877,2001)。PEG化已经应用于人生长因子(Kim等,Biomaterials 23:2311-2317,2002;Wu等,Protein Expr.Purif.48:24-27,2006)、生长激素释放因子(Piquet等,J.Chromatogr.944:141-148,2002)、腺病毒载体(Eto等,Int.J.Pharm.354:3-8,2008)和质粒DNA(Hosseinkhani等,J.Control Release,97:157-171,2004)。由于PEG化的益处，已经开发出许多缀合反应化学(Roberts等.,Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476,2002)和聚合物衍生物(欧洲专利No.1578841)。随着生物分子-聚合物缀合物的应用增加，有必要开发简单的、可再现的、且可缩放的(scalable)单元操作来满足制造需要。

发明概述

本发明涉及一种用于生成生物分子缀合物的方法，包括下列步骤：通过与活化剂接触活化生物分子；除去所述活化剂；并通过将所述生物分子与活化的聚合物起反应缀合所述生物分子；其中将该方法的步骤整合入单一单元操作中。该方法可以进一步包括分开所述生物分子缀合物与未缀合的生物分子的步骤。在一个实施方案中，通过大小排阻层析或离子交换层析分开所述生物分子缀合物与未缀合的生物分子。

在一个实施方案中，单一单元操作是集成的切向流过滤系统。在另一个实施方案中，活化剂选自缓冲液更换、pH调节、或还原剂。在又一个实施方案中，还原剂是二硫苏糖醇或三2-羧乙基膦(tris 2-carboxyethyl phosphine)。在其它实施方案中，聚合物是聚乙二醇，且生物分子选自：蛋白质、多糖和核酸。在又一个实施方案中，所述蛋白质选自凝固因子、抗体、激素、生长因子和酶。

附图简述

图1：PEG化对照运行的阳离子交换层析洗脱谱(profile)。

图2：来自PEG化对照运行的阳离子交换层析洗脱峰的SDS-PAGE。

图3：来自PEG化对照的阳离子交换层析洗脱峰的大小排阻层析。

图4：以TFF模式实施的PEG化的阳离子交换层析洗脱谱。

图5：实验室规模TFF运行的阳离子交换层析洗脱谱。

图6：由实验室规模TFF运行生成的PEG化rFVIII的SEC谱。

图7：试验(pilot)规模TFF运行的阳离子交换层析洗脱谱。

发明详述

应当理解，本发明不限于所描述的具体装置或部分，并且因此可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅由所附权利要求书限制。

必须注意到，如本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。如此，例如，提及“药剂”指提及一种或多种药剂(agent)，并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。